藏藥檀香清咽片對(duì)慢性支氣管炎模型大鼠支氣管肺MyD88/NF-κB/ICAM-1信號(hào)通路的影響

邵國(guó)強(qiáng)，杜 青，李躍輝，達(dá)瓦桑珠，扎西次仁

(1. 湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410006；2. 西藏自治區(qū)山南市藏醫(yī)醫(yī)院，西藏 山南 856000)

慢性支氣管炎(chronic bronchitis，CB)是臨床上常見(jiàn)的以慢性咳嗽咳痰、伴隨喘息為主要特征的呼吸系統(tǒng)疾病，可能通過(guò)環(huán)境暴露、遺傳易感性或大量接觸有害顆粒或氣體(例如香煙煙霧)激活，具有高發(fā)性、易感性等[1]。CB的進(jìn)展與氣管、支氣管黏膜和周?chē)M織的慢性非特異性炎癥有關(guān)，長(zhǎng)時(shí)間可導(dǎo)致一系列支氣管肺組織結(jié)構(gòu)功能改變和代謝異常，嚴(yán)重者甚至引起阻塞性肺氣腫、肺源性心血管疾病、肺癌等[2]。CB的治療常采用吸氧、抗生素、祛痰藥等聯(lián)合應(yīng)用的方法，會(huì)出現(xiàn)周期延長(zhǎng)的特點(diǎn)，因此，探討慢性支氣管炎發(fā)生機(jī)制并篩選有效的預(yù)防或治療的藥物至關(guān)重要。藏藥檀香清咽片由檀香、叢菔、紫花亞菊、唐古特烏頭、秦艽花和青藏龍膽組成，具有“清熱解毒、止咳化痰、潤(rùn)肺利咽”的功效，臨床已經(jīng)證實(shí)對(duì)咽喉炎、支氣管炎等呼吸道感染引起的咳嗽、咳痰、氣喘等癥狀有明顯的的治療效果。CB的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，支氣管肺組織細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)激活釋放細(xì)胞因子(TNF-α、IL-10)和炎性介質(zhì)(NF-κB)在其中發(fā)揮著重要作用[3-4]。因此，本研究通過(guò)觀察檀香清咽片對(duì)脂多糖煙霧誘導(dǎo)慢性支氣管炎模型大鼠支氣管肺炎性浸潤(rùn)程度、炎性介質(zhì)MyD88/NF-κB/ICAM-1信號(hào)通路的影響，以期為民族藥的開(kāi)發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物SD大鼠，70只，♂，SPF級(jí)，體質(zhì)量(180～220) g；由湖南省斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0004，合格證編號(hào)：430727211100275116。實(shí)驗(yàn)程序根據(jù)湖南省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SOP進(jìn)行，所有程序均按照中國(guó)科學(xué)技術(shù)部制定的“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指導(dǎo)意見(jiàn)”進(jìn)行，批準(zhǔn)編號(hào)：2021-0007。允許大鼠在恒定溫度、濕度和光暗循環(huán)[(20～26) ℃; 40%～70%；07 ∶00～19 ∶00光照循環(huán)]下自由飲水和進(jìn)食。

1.2 儀器Envision2105型酶標(biāo)儀(PE公司)；RM2245型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；奧林巴斯BX53型生物顯微鏡(Olympus 公司)；7DZ5-WS型低溫低速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器公司)；PANNORAMIC型全景切片掃描儀(匈牙利3DHISTECH公司)；DYY-6C型電泳儀(北京六一)；DYCP-31DN型水平瓊脂糖電泳槽(北京六一)；ChemiDocTMXRS+型凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3 藥物及試劑檀香清咽片(批號(hào)20201101)，由檀香、叢菔、紫花亞菊、唐古特烏頭、秦艽花、青藏龍膽6味藥組成，比例為：37 ∶37 ∶37 ∶30 ∶30 ∶30，由湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所制劑室提供并制成超微粉，臨床使用劑量為4 g生藥·d-1，按照體表面積換算成大鼠等效劑量為0.36 g·kg-1，檀香清咽片高、中、低劑量即為臨床等效劑量的4倍、2倍、1倍(1.44、0.72、0.36 g·kg-1)；陽(yáng)性藥：桂龍瑞咳寧片(批號(hào)：200403，1 g·kg-1)，江西藥都仁和制藥有限公司；脂多糖(LPS，Sigma公司，批號(hào)：L2880)；TNF-α和IL-10 ELISA試劑盒(Elabscience公司，批號(hào)：E-EL-R2856c，E-EL-R0016c)；MyD88一抗(ABclona公司，批號(hào)：A0786)，NF-κB一抗(Proteintech公司，批號(hào)：66535-1-Ig)，ICAM-1一抗(Proteintech公司，批號(hào)：10020-1-AP)，肌動(dòng)蛋白(actin，Proteintech公司，批號(hào)：66009-1-Ig)；HRP標(biāo)記山羊抗兔(Proteintech公司，批號(hào)：SA00001-2)；HRP標(biāo)記山羊抗大鼠(Proteintech公司，批號(hào)：SA00001-1)；trizol(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：V900483)；SuperECL Plus 超敏發(fā)光液(美國(guó)advansta公司，批號(hào)：K-12045-D50)。

2 方法

2.1 慢性支氣管炎大鼠模型建立SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，按體重隨機(jī)分為：正常組(n=8)、假手術(shù)組(n=8)和模型組(n=54)，模型組造模方法：每天將大鼠置于煙熏箱內(nèi)，進(jìn)行兩次煙熏，上下午各一次，每次熏1 h，每次煙熏量為10支香煙，兩次煙熏之間間隔4 h(手術(shù)當(dāng)天取消熏煙)。d 15，模型組大鼠采用1%戊巴比妥鈉溶液(50 mg·kg-1)腹腔麻醉后，固定在板上，暴露聲門(mén)，將200 μg(2 g·L-1)LPS溶液快速注入氣管，然后將固定板垂直旋轉(zhuǎn)，使脂多糖均勻分布于兩肺，在造模后，大鼠禁食不禁水6 h。

2.2 分組與給藥在熏煙15 d后，將上述模型組大鼠按體重隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性藥(桂龍瑞咳寧片1 g·kg-1)組、檀香清咽片高、中、低劑量(1.44、0.72、0.36 g·kg-1)組，每組10只。繼續(xù)煙熏造模的同時(shí)，藥物干預(yù)組灌胃給予相應(yīng)藥物，正常組、假手術(shù)組和模型組給予等體積純凈水，連續(xù)給藥15 d。

2.3 一般行為、體征與解剖觀察實(shí)驗(yàn)過(guò)程過(guò)中每周稱定動(dòng)物體質(zhì)量以調(diào)整用藥劑量，并詳細(xì)觀察動(dòng)物背毛、眼、耳、尾，精神狀態(tài)和活動(dòng)等情況。

2.4 樣本采集和制備因?yàn)槭中g(shù)后每組動(dòng)物有一定的死亡率，給藥結(jié)束后次日，各組選取7只大鼠，采用1%戊巴比妥鈉溶液(50 mg·kg-1)腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈取血，離心(3 000 r·min-1，15 min)，取上清液，-80 ℃保存待用。然后，打開(kāi)大鼠胸腔，完整取出全部支氣管肺組織，右側(cè)肺臟液氮凍存?zhèn)溆茫蛔髠?cè)肺組織10%中性甲醛溶液固定備用。

2.5 血清炎癥因子檢測(cè)將凍存的血清樣本梯度放入-20 ℃和4 ℃解凍后，試劑盒平衡到室溫，配制洗滌液、標(biāo)準(zhǔn)工作液、生物素化抗體工作液、酶結(jié)合物工作液，按照Elisa試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟加樣、溫育、洗板、檢測(cè)血清中TNF-α、IL-10含量變化。

2.6 支氣管肺組織病理切片HE染色各組大鼠支氣管和左側(cè)部分肺組織制成石蠟切片。將脫蠟的切片放染色架上，蘇木精染色，1%的鹽酸內(nèi)分色。水洗，溫水或弱堿性水溶液反藍(lán)，伊紅染色，脫水，封片。通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化(400×)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模成功的主要表現(xiàn)為支氣管周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn)狀況，管腔內(nèi)有無(wú)滲出物，肺泡壁間質(zhì)炎及肺泡氣腫改變等。支氣管炎癥浸潤(rùn)程度：觀察切片中所有支氣管炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況，計(jì)數(shù)炎細(xì)胞浸潤(rùn)支氣管和非浸潤(rùn)支氣管數(shù)目，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。

2.7 Western blot法定量檢測(cè)MyD88/NF-κB/ICAM-1蛋白表達(dá)將支氣管肺組織剪碎，在冰上勻漿，加入裂解液裂解30 min，12 000 r·min-14 ℃離心5 min，取上清液進(jìn)行蛋白定量，調(diào)整蛋白量后，取等量裂解產(chǎn)物，加入上樣緩沖液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入脫脂牛奶中室溫封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌，加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌，化學(xué)發(fā)光法顯色，成像掃描分析系統(tǒng)保存圖像。以actin蛋白表達(dá)水平作為內(nèi)參，以各樣本與相應(yīng)內(nèi)參灰度值比值為蛋白相對(duì)含量。

2.8 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)MyD88/NF-κB/ICAM-1蛋白表達(dá)取固定的肺組織進(jìn)行石蠟包埋，自動(dòng)切片機(jī)切取厚度為0.4 μm的組織切片。用二甲苯及系列乙醇脫蠟脫水；PBS沖洗，3% H2O2室溫孵育10 min滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；PBS沖洗；10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10 min；滴加1 ∶50兔抗大鼠一抗，4 ℃過(guò)夜；滴加生物素標(biāo)記二抗，37 ℃孵育30 min；DAB顯色；沖洗，終止顯色；蘇木精復(fù)染、脫水、封片，在光學(xué)顯微鏡(100×)下觀察每張載玻片3個(gè)不重復(fù)視野并統(tǒng)計(jì)MyD88、NF-κB和ICAM-1的陽(yáng)性細(xì)胞率。

3 結(jié)果

3.1 檀香清咽片對(duì)慢性支氣管炎大鼠一般情況的影響造模后，模型組大鼠皮毛光澤逐漸喪失、活動(dòng)量減少、情緒倦怠，飲水量和排尿量明顯增加，可以聽(tīng)到氣道哮鳴音和痰鳴音，體質(zhì)量明顯減輕(P<0.01)；給予檀香清咽片藥物干預(yù)后，氣道哮鳴音明顯緩解。體質(zhì)量變化情況見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Effects of Tanxiang Qingyan Tablets on body mass of rats with chronic bronchitis

3.2 檀香清咽片對(duì)慢性支氣管炎大鼠血清炎癥因子的影響與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中TNF-α含量明顯升高，IL-10含量明顯降低；與模型組比較，檀香清咽片高、中劑量組可明顯降低血清TNF-α含量(P<0.05，P<0.01)，但對(duì)IL-10含量改變差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)Tab 2。

Tab 2 Effects of Tanxiang Qingyan Tablets on serum inflammatory factors in rats with chronic bronchitis

3.3 檀香清咽片對(duì)慢性支氣管炎大鼠支氣管肺組織病理形態(tài)的影響正常組大鼠支氣管黏膜上皮細(xì)胞完整，無(wú)充血水腫現(xiàn)象，細(xì)胞排列整齊，肺組織結(jié)構(gòu)肺泡無(wú)明顯病理改變；模型組大鼠支氣管黏膜上皮細(xì)胞受損嚴(yán)重，大量壞死脫落，杯狀細(xì)胞增生，管壁大量纖維組織增生，管壁明顯增厚，管腔狹窄，管腔內(nèi)充滿分泌物及滲出物，肺泡隔增寬，有不同程度的炎細(xì)胞浸潤(rùn)及毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，非浸潤(rùn)支氣管數(shù)減少(P<0.01)；與模型組比較，陽(yáng)性藥組大鼠肺組織損傷和炎性改變減輕較為明顯，支氣管黏膜上皮無(wú)嚴(yán)重受損，管腔和肺泡腔內(nèi)少有壞死脫落細(xì)胞及滲出物，見(jiàn)少量纖維組織及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，水腫、充血不明顯。檀香清咽片組大鼠支氣管黏膜上皮受損程度較輕，管腔和肺泡腔內(nèi)有少量壞死脫落細(xì)胞及滲出物，肺組織損傷和炎性改變減輕，管壁增厚，肺泡隔增寬，見(jiàn)少量纖維組織及炎細(xì)胞浸潤(rùn)水腫(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)Fig 1，Tab 3。

Fig 1 Effect of Tanxiang Qingyan Tablets on pathological morphology of bronchopulmonary tissues in rats with chronic bronchitis (HE×400)

Tab 3 Effects of Tanxiang Qingyan Tablets on infiltration of bronchial inflammatory cells in rats with chronic bronchitis

3.4 檀香清咽片對(duì)慢性支氣管炎大鼠支氣管肺組織MyD88/NF-κB/ICAM-1蛋白表達(dá)的影響與假手術(shù)組比較，模型組大鼠支氣管肺組織MyD88、NF-κB和ICAM-1蛋白灰度值和陽(yáng)性表達(dá)率明顯上升(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，陽(yáng)性藥組和檀香清咽片組大鼠支氣管肺組織MyD88、NF-κB和ICAM-1蛋白灰度值和陽(yáng)性表達(dá)率陽(yáng)性表達(dá)率明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)Fig 2，3，Tab 4，5。

Fig 2 Effect of Tanxiang Qingyan Tablets on MyD88/NF-κB/ICAM-1 protein bands in bronchopulmonary tissues of rats with chronic bronchitis

Tab 4 Effect of Tanxiang Qingyan Tablets on gray value of MyD88/NF-κB/ICAM-1 protein in bronchopulmonary tissues of rats with chronic bronchitis

Tab 5 Effect of Tanxiang Qingyan Tablets on positive rate of MyD88/NF-κB/ICAM-1 protein expression in bronchopulmonary tissues of rats with chronic bronchitis

4 討論

我國(guó)的慢性支氣管炎發(fā)病率約為4.0%，老年患者約占6%～20%，嚴(yán)重影響人類的生活質(zhì)量[5]。CB的生理病理過(guò)程主要是中央氣道上皮受損、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、平滑肌細(xì)胞肥大等；炎癥反應(yīng)是CB發(fā)生發(fā)展的核心機(jī)制，多種炎癥因子間相互作用，繼發(fā)黏液高分泌、上皮免疫功能下降、氣道表面脫水及氣道重塑[6]。減少細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)等促炎因素的產(chǎn)生成為治療CB的關(guān)鍵。

Fig 3 Results of immunohistochemical staining of MyD88，NF-κB and ICAM-1 proteins in bronchopulmonary tissues of rats in each group (×100)A: Control B: Sham C: Model D: Positive drug E: High F: Medium G: Low

本研究采用熏煙法聯(lián)合脂多糖(LPS)誘導(dǎo)CB模型，LPS是重要的致炎因子，可引起氣道上皮細(xì)胞損傷，誘發(fā)氣道炎癥。LPS與細(xì)胞膜上Toll受體結(jié)合可誘導(dǎo)一系列復(fù)雜炎癥反應(yīng)，髓樣分化因子88(MyD88)是Toll信號(hào)的一種關(guān)鍵連接分子，很好的反應(yīng)機(jī)體炎癥損害程度[7-8]。NF-κB由p50/p65亞單位形成的異源二聚體存在于細(xì)胞漿中，可與多種細(xì)胞基因的增強(qiáng)子或啟動(dòng)子特異性結(jié)合，是調(diào)控炎癥過(guò)程中的關(guān)鍵因子。MyD88依賴的Toll途徑可促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生，從而激活NF-κB信號(hào)通路，誘發(fā)多種炎癥因子(如IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1等)的表達(dá)，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞在炎癥部位的聚集和浸潤(rùn)[9-10]。以往研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB在介導(dǎo)呼吸道炎癥中發(fā)揮重要作用，已成為治療CB的潛在靶點(diǎn)[11]。細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)作為NF-κB的下游炎癥遞質(zhì)，主要參與細(xì)胞識(shí)別、活化和信號(hào)傳導(dǎo)，在免疫應(yīng)答和炎癥發(fā)生等方面具有重要作用[12]。機(jī)體正常情況下低水平表達(dá)，出現(xiàn)組織損傷后，可經(jīng)NF-κB調(diào)控和白介素等炎性因子誘導(dǎo)活化，與白細(xì)胞表面淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原相互作用，促使相關(guān)抗原陽(yáng)性白細(xì)胞黏附于ICAM-1陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞表面，進(jìn)一步到達(dá)炎癥組織，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的遷移和趨化[13-14]。

TNF-α是LPS介導(dǎo)CB發(fā)病過(guò)程中最早釋放的主要前炎性細(xì)胞因子之一，也是NF-κB信號(hào)通路的下游分子，能夠激活免疫細(xì)胞促進(jìn)炎癥因子的釋放，進(jìn)而介導(dǎo)肺組織炎癥反應(yīng)的過(guò)程，誘發(fā)或加重支氣管炎癥[15]。IL-10具有抑制促炎細(xì)胞因子合成與釋放的抗炎作用，是一種多細(xì)胞源多功能細(xì)胞因子[16]。本研究ELISA檢測(cè)CB模型大鼠外周血清中TNF-α和IL-10含量，發(fā)現(xiàn)檀香清咽片可有效調(diào)控促炎因子TNF-α的水平，但對(duì)IL-10的水平改變無(wú)顯著性差異，針對(duì)抑炎因子是否有調(diào)控作用后續(xù)將采用多種方法進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究另外采用Western blot法和免疫組織化學(xué)雙重定量定性考察炎性介質(zhì)MyD88、NF-κB和ICAM-1蛋白在CB模型大鼠支氣管肺組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)檀香清咽片可明顯抑制CB模型大鼠MyD88/NF-κB/ICAM-1信號(hào)通路的激活，減少支氣管肺組織的炎性浸潤(rùn)，改善氣道和肺部炎癥狀況。本研究HE染色結(jié)果也表明，檀香清咽片可有效改善CB模型大鼠支氣管黏膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度，減少杯狀細(xì)胞和管壁大量纖維增生，增加管腔內(nèi)徑，緩解支氣管肺部炎癥。檀香清咽片可有效改善支氣管肺組織炎性浸潤(rùn)，可能與減少炎性介質(zhì)TNF-α等的釋放，可能與調(diào)控MyD88/NF-κB/ICAM-1信號(hào)通路表達(dá)有關(guān)。本研究從炎癥介質(zhì)調(diào)控方面探討了檀香清咽片治療慢性支氣管炎作用和機(jī)制，其他作用機(jī)制需進(jìn)一步研究證實(shí)。