黃芪水煎劑對流感病毒感染Raw264.7細胞的保護作用及機制

梁羽茜，王如峰，黃松麗，張秋艷，劉曉燕，胡秀華

(北京中醫藥大學,北京 100029)

課題組前期實驗發現黃芪注射液可通過調控TLR3信號通路保護流感病毒感染的Raw264.7細胞[1]。本次研究選擇了不同黃芪劑型，即黃芪水煎劑(Astragalus decoction，AD)進行后續實驗，重點探討AD對流感病毒的作用及機制，為其臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病毒株 亞洲甲型鼠肺適應株 A/FM/1/47(H1N1)由中國預防醫學科學院病毒學研究所提供。據Reed & Muench法得出流感病毒的TCID50為10-3.62/0.1mL。

1.1.2試劑與儀器 中藥黃芪購自北京同仁堂股份有限公司(批號：20111302)，經傳統中藥煎煮法煎煮而成；CO2細胞培養箱(BINDER，德國)，酶標儀(Bio-Tek，美國)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養與分組 小鼠Raw264.7細胞購自北京協和醫學院細胞資源中心，按照1 ∶3～1 ∶5的比例傳代培養。實驗分為正常組(Normal組)、加藥組(AD組)、病毒對照組(Virus組)、病毒加藥組(Virus+AD)。

1.2.2細胞增殖實驗 Raw264.7細胞Normal組加入細胞培養液，AD組加入含藥細胞培養液，培養24 h、48 h、72h后檢測OD值，計算藥物IC0、IC10、IC25劑量用于后續實驗。

1.2.3抗流感病毒活性 Raw264.7細胞Normal組、Virus組、Virus+AD組進行相應病毒感染及加藥處理后培養72 h，檢測OD值。

1.2.4流式細胞術檢測細胞周期 Raw264.7細胞各組進行相應處理后培養72h收集細胞。固定、染色后，檢測并分析細胞增殖周期。

1.2.5超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定 使用SOD及MDA檢測試劑盒，按照說明書操作，并計算各組細胞內SOD及MDA值。

1.2.6Western blot測定TLR3信號通路相關蛋白表達 提取各組蛋白并測定濃度。蛋白變性定量后電泳，電轉至PVDF膜孵育一抗、二抗，曝光顯影后分析目的條帶。

2 結果

2.1 AD對Raw264.7細胞增殖的影響AD對Raw264.7細胞的增殖具有抑制作用，且呈時間和劑量依賴性。統計軟件計算出72 h相應IC0、IC10及IC25為0.2 g·L-1、1.6 g·L-1、5 g·L-1。

2.2 AD改善流感病毒感染Raw264.7細胞的增殖能力如Tab 1所示，與Virus組相比，0.2 g·L-1AD干預72 h后可降低病毒對細胞增殖的抑制作用(P<0.01)。

Tab 1 Results of anti-influenza virus activities of AD for 72 h n=4)

2.3 AD改善流感病毒所致的Raw264.7細胞G1期阻滯如Tab 2所示，與Virus組相比，Virus+AD組G1期細胞百分比降低(P<0.01)，S期細胞百分比升高(P<0.01)。

Tab 2 Effects of AD on cell cycle of Raw264.7 n=3 )

2.4 AD對細胞內SOD、MDA的影響與Virus組相比，0.2 g·L-1AD干預可使流感病毒感染后細胞內SOD升高(P<0.01)，MDA降低(P<0.01)，如Tab 3所示。

Tab 3 Effects of AD on content of SOD and

2.5 AD調控TLR3信號通路關鍵蛋白的表達與Virus組相比，藥物干預后，Virus+AD組中TLR3、TBK1、IRF3的表達升高(P<0.01)，但不同劑量AD對相關因子調控結果不同。

3 討論

甲型流感病毒易突變，傳染性強，屬于高致病性流感病毒亞型[2]。中藥黃芪具有抗病毒[3]、抗腫瘤[4]、抗炎性損傷以及保護心血管等多種生物學功能[5-6]。本實驗結果顯示黃芪水煎劑具有抗流感病毒活性，可改善流感病毒所致的細胞G1期阻滯，使細胞內SOD升高，MDA降低，并影響TLR3信號通路關鍵蛋白表達。此外，在研究過程中，我們發現黃芪注射液和黃芪水煎劑在TLR3信號通路相關的抗病毒機制上存在差異，推測可能由不同劑型成分差異所致，對此我們將作進一步研究。

(致謝：本實驗在北京中醫藥大學生命科學學院生物科學系完成，在此表示感謝!)