膽、腸菌群差異性與膽囊膽固醇結石形成關系

杜國濤，王青，趙偉偉，張兆波，孫悅，趙鵬程，劉建中

（滄州市人民醫院 胃腸外科，河北 滄州 061000）

據最新統計，目前發達國家和地區膽結石患病率達20%；我國膽結石患病率為10%，膽囊膽固醇結石患者占比超80%，并呈逐年增加趨勢[1]。隨著我國居民飲食習慣的改變，以膽汁膽固醇過飽和造成的膽囊膽固醇結石病例為主要亞型，其次為膽囊運動功能異常亞型。膽囊運動障礙、膽固醇代謝紊亂、膽固醇反向轉運、代謝紊亂綜合征可導致膽固醇超飽和，引起膽固醇、膽汁酸鹽及磷脂三者比例失衡，進而形成膽結石[2]。膽囊膽固醇結石是一種多發的常見病，結石的形成過程極其復雜，目前關于其形成原因學界尚存爭議，蔣婷等[3]認為膽固醇結石的形成機制主要包括膽汁中膽固醇超飽和、成核因子致微泡穩態失衡和膽汁纖溶系統紊亂；Swidsinski等[4]認為細菌源性物質可通過影響人體免疫代謝產物，進而促使膽囊膽固醇結石的形成；王強等[5]認為腸道微生態失衡可影響膽汁酸的肝腸循環，導致膽汁酸和膽固醇代謝紊亂，在膽固醇結石的發生過程中發揮重要作用；蔣兆彥等[6]認為膽固醇結石形成的首要條件是膽汁膽固醇過飽和。膽道菌群與人體免疫代謝協同作用可致使膽囊膽固醇結石的形成；同時，腸道菌群代謝與人體免疫代謝密切相關。故本文基于膽囊膽固醇結石患者膽道菌群、腸道菌群差異性，探討膽、腸菌群交互與膽囊膽固醇結石形成關系，為其他結石類基本的形成原因提供參考。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選擇2020年1 月至2020年6 月由滄州市人民醫院診療的膽囊膽固醇結石患者42例為研究對象，記入膽固醇結石組；同時，選取同時期于本院接受膽囊炎、膽囊息肉診治等非膽固醇結石患者40例為非膽固醇結石組。兩組患者年齡40～65歲，膽固醇結石組平均年齡（47.8±10.2）歲，非膽固醇組平均年齡（45.3±4.9）歲。非膽固醇結石組男、女各20例；膽固醇結石組中男18例，女24例。兩組患者的性別、年齡、體重、病程等一般資料比較均無統計學意義（P＞0.05）。本研究已獲批滄州市人民醫院倫理委員會批準，所有的患者均簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器

QIAamp DNA Stool Mini Kits化學裂解試劑盒（QIAGEN公司，德國）；MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN公司，德國）；免疫球蛋白IgA、IgG、IgM試劑盒（上海酶聯科技生物有限公司，中國）。DYY-61型電泳儀（北京六一儀器廠，中國）；Illumina HiSeq測序平臺（Illumina公司，美國）；MJ PCT220 PCR（MJ公司，美國）。

1.3 樣品收集

非膽固醇結石組和膽固醇結石組患者均采用術中膽囊穿刺法收集膽汁1.5～2.0 mL；膽固醇結石組在不碎石的情況下，術中收集直徑為0.8～1.0 cm的結石，且以無菌生理鹽水沖洗；同時，收集膽固醇結石患者和非膽固醇結石患者手術前一天或當天晨起糞便約10 g；所有樣本于收集后，迅速經液氮淬滅后置于-80 ℃冰箱內保存。

1.4 DNA提取與建庫測序

非膽囊膽固醇結石患者和膽囊膽固醇結石患者膽汁、結石及糞便DNA 提取采用物理破碎及QIAamp DNA Stool Mini Kits化學裂解試劑盒相結合進行。建庫測序：提取樣品總DNA后，參照相關文獻設計得到引物，在引物末端加上測序接頭，進行16S rRNA基因VI-V2可變區域的PCR擴增，并采用瓊脂糖凝膠電泳及MinElute Gel Extraction Kit進行對PCR產物進行純化、采用Quant-iTPicGreen dsDNA Kit進行定量分析和均一化形成測序文庫，經質檢合格的文庫樣本用Illumina HiSeq 2500進行測序，并進行細菌OTU鑒定。

1.5 膽囊膽固醇結石的定量分析

精密稱重所有結石樣本，經氯仿/甲醇（2:1）萃取后，采用CHOD-PAP法及NanoDrop 2000 分光光度計對結石樣本定量分析膽固醇含量。

1.6 細菌DNA檢出率及細菌菌落數比較

利用qPCR方法檢測兩組患者膽汁樣本中DNA陽性率及菌落數。

1.7 膽汁免疫球蛋白檢測

采用放射免疫檢測試劑盒免疫計數儀檢測膽汁免疫球蛋白IgA、IgG和IgM表達水平。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 兩組細菌DNA檢出率及細菌菌落數的比較

非膽固醇結石組患者膽汁細菌DNA 陽性率47.50%（19/40）低于膽固醇結石組69.04%（29/42）（χ2=3.919，P＜0.05）；同時膽汁細菌菌落數（3.29±1.21）低于膽固醇結石組（5.74±1.08）（P＜0.001）。

2.2 兩組膽汁免疫球蛋白檢測比較分析

膽固醇結石組患者膽汁中IgA（P＜0.001）和IgM（P＜0.05）含量顯著高于非膽固醇結石組，IgG含量略高于非膽固醇結石組，但差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 膽汁免疫球蛋白檢測比較

2.3 膽囊膽固醇結石的定量分析

依據Marschall、Swidsinski和Portincasa學者對膽固醇結石中膽固醇含量的定義，在所有結石樣本中，膽固醇含量在≤70%、70%～89%及≥90%分別為3、38及1例。

2.4 兩組菌群分析

測序數據質量評估：根據膽汁及糞便樣本各階段的序列長度（AvgLen（bp）），G和C類型的堿基占總堿基的百分比（GC），質量值≥20 或30 的堿基占總堿基數的百分比（Q20 和Q30），有效的優化序列的百分比（Effective）等參數對所有樣本數據進行評估，見表2。結果表明所有測序樣本Q20和Q30大于90%，優化序列的百分比均大于80%，符合質量評估要求[7]。

表2 樣品測序數據處理分析

對優化序列在97%的相似度水平下進行聚類、獲得OTU數目，可知糞便樣本膽固醇結石組OTU數目顯著小于非膽固醇結石組（P＜0.001）。并分別從界（Kindom）、門（Phylum）、綱（Class）、目（Order）、科（Family）、屬（Genus）、種（Species）展示各等級物種數目統計，可知膽汁樣本膽固醇結石組種數目顯著大于非膽固醇結石組（P＜0.001），見表3。

表3 樣品各等級物種統計表

對樣品Alpha多樣性指數進行評估，如表4 所示。Chao1和Ace指數衡量物種豐度即物種數量的多少，可得出糞便樣本膽固醇結石組Chao1和Ace指數顯著低于非膽固醇結石組，即膽固醇結石患者膽汁菌群物種數量顯著小于非膽固醇結石組（P＜0.001）。Shannon和Simpson指數用于衡量物種多樣性，據Shannon指數值越大，Simpson指數值越小，說明樣品的物種多樣性越高，可知膽固醇結石患者糞便菌群物種多樣性小于非膽固醇結石組。此外，由稀釋性曲線及Shannon指數曲線均表明膽固醇結石患者糞便樣本多樣性少于非膽固醇結石組，見圖1。

圖1 兩組稀釋性曲線（A、B）及Shannon指數曲線（C、D）

表4 Alpha多樣性指數分析

鑒于細菌門類型的保守性，其作為最高的分類單元，可異質性反映人體特定部位細菌群落結構，故在本實驗中先期對細菌在門水平上進行解析。從中可知，厚壁菌門（Firmicutes）和梭桿菌門（Fusobacteria）為膽汁中的優勢細菌類群，厚壁菌門、放線菌門（Actinobacteria）及擬桿菌門（Bacteroidetes）為糞便樣本中的優勢細菌類群。其次，人體特定部位微環境常常由細菌種屬水平來反映，在本實驗中，膽固醇結石組膽汁及糞便樣本中Roseburia相對豐度均顯著低于非膽固醇結石組；且非膽固醇結石組糞便樣本中Sporococcus相對豐度顯著高于膽固醇結石組。見圖2。

圖2 兩組菌群分析

3 討論

隨著人民生活水平的穩步提高，膳食結構以及生活方式發生了很大變化，如過量攝入高脂肪、高糖類、高膽固醇食物，早餐不規律，缺乏運動等不健康生活習慣均是形成膽結石的重要因素。膽結石又稱膽石癥，是指膽道系統包括膽囊或膽管內發生結石的疾病；包括膽囊結石、膽總管結石、肝膽管結石[8]。膽囊結石的患者數量越來越多，我國發病率高達10%，且集中在＞40歲的人群，主要為膽固醇結石；其發生不僅與年齡，飲食，行為習慣相關，且受肥胖、高脂血癥、2型糖尿病、肝硬化等相關疾病因素的影響；另外，妊娠作為膽囊結石常見病因之一，使得女性發病率遠高于男性[9]。膽固醇結石的形成與個體中含造石基因的遺傳因素、肝膽固醇的過度分泌、膽汁的過飽和及快速相變、膽囊的運動減弱、腸道菌群等因素有關[10]。膽囊膽固醇結石是一種消化系統常見疾病，發病率逐漸升高，若不及時治療，極有可能引起繼發感染，導致膽囊癌及膽道系統惡性腫瘤的發生，危害患者生命安全。膽囊膽固醇結石的形成原因較復雜，發生機制尚未完全闡明。目前已有研究表明，膽色素結石、混合性結石、膽固醇結石中均存在細菌，而細菌可以促進膽固醇過飽和、產生促成核因子、促進免疫球蛋白和黏液蛋白分泌，從而參與結石的形成[5]。由此推測，膽道細菌感染與膽囊結石的形成有著密切關系。

正常生理狀態下，腸道菌群參與人體內物質與能量代謝，促進免疫系統發育與成熟，可形成屏障隔斷病原體對宿主的攻擊，從而維持人體內穩態[11-12]。然而，一旦腸道微生態失衡，就可能引起腸炎、結腸癌和膽囊結石等慢性疾病的發生與發展[5，13]。因此，腸道菌群失衡是膽固醇結石發生的關鍵因素。因此，本文基于膽囊膽固醇結石患者膽道菌群、腸道菌群差異性，對膽、腸菌群交互與膽囊膽固醇結石形成關系進行了探討。結果顯示，非膽固醇結石組患者膽汁細菌DNA陽性率47.50%（19/40）低于膽固醇結石組患者膽汁細菌DNA陽性率69.04%（29/42）（P＜0.05）；細菌菌落數亦低于膽固醇結石組（P＜0.05）。膽汁免疫球蛋白檢測結果表明，膽固醇結石組患者膽汁中IgA含量顯著高于非膽固醇結石組（P＜0.05）。菌群分析結果顯示，厚壁菌門（Firmicutes）和梭桿菌門（Fusobacteria）為膽汁中的優勢細菌類群，厚壁菌門、放線菌門（Actinobacteria）及擬桿菌門（Bacteroidetes）為糞便樣本中的優勢細菌類群。

目前，有關膽道菌落結構與膽囊結石關系的研究報道較少。一個世紀前有學者在膽結石患者的膽汁中培養出了多種細菌，推測結石的形成與膽道細菌感染離不開[14]。研究表明，雖膽囊膽固醇結石患者與正常人在菌群結構上無明顯差異，但與正常人相比，患者的免疫球蛋白水平明顯升高，這提示結石的形成可能與免疫球蛋白水平有關[15-17]。免疫球蛋白IgA、IgG可提升膽固醇成核活性，影響膽囊膽固醇結石患者的膽道內菌群，進而促進膽結石的形成[15]。方馳華等[18]率先證實膽囊結石中存在細菌，并認為細菌是形成結石的重要因素。Lee等[19]研究表明腸源細菌在結石形成過程中發揮重要作用；陶應田等[20]認為膽汁中游離膽紅素增多，引起細菌感染，導致結石形成。本實驗對膽汁免疫球蛋白進行了檢測，發現膽固醇結石組患者膽汁中IgA（P＜0.001）和IgM（P＜0.05）含量顯著高于非膽固醇結石組，由此可推斷膽囊膽固醇結石的形成與膽汁免疫球蛋白水平有關。實驗結果顯示非膽固醇結石組患者細菌菌落數（3.29±1.21）顯著低于膽固醇結石組患者細菌菌落數（5.74±1.08）（P＜0.001），推測膽囊膽固醇結石患者膽道內菌群與結石的形成存在一定的關系。

腸道微生物參與調控人體免疫系統、物質的能量代謝、涉及氨基酸、維生素等必需營養物質的生物合成，在維持機體穩態中發揮重要作用。腸道菌群隨著外界環境、飲食結構、年齡等因素的改變而波動，但整體維持在一定范圍。代謝性疾病的發生往往伴隨著腸道微生態失衡；而膽囊結石是一種常見的消化系統疾病，膽汁酸代謝紊亂是其形成的重要因素，且膽汁酸的代謝受腸道菌群的調節[21]。因此，從腸道菌群與膽汁酸的關系的角度探討膽囊結石的成因，是很有必要的。Wu等[13]以膽囊結石患者及正常人的膽汁及糞便為研究對象，首次采用16S rRNA擴增子測序技術對其進行研究，結果顯示膽囊結石患者存在明顯的腸道菌群失調。劉超等[2]認為膽固醇結石的發生與膽汁中膽固醇濃度、促/抑成核因子的動力學穩態有關。Keren等[22]發現膽囊切除后，膽汁的流向發生了改變，引起膽汁酸與腸道微生物之間的關系發生改變，進而認為結石患者治療后復發率高可能與腸道菌群的改變有關。鄧太平等[23]研究發現，膽石癥患者存在胃腸道健康風險，且其體內腸道菌群明顯失調。Wang等[24]發現膽固醇結石小鼠腸道中厚壁菌門及其與擬桿菌比值均降低；研究表明無菌小鼠腸道接種細菌后，膽汁酸合成減少，從而促進膽固醇結石發生，提示膽汁酸的合成與腸道菌群有關[25-26]。

通過實驗我們發現，膽固醇結石患者膽汁菌群物種數量顯著小于非膽固醇結石組，糞便菌群物種多樣性小于非膽固醇結石組；厚壁菌門和梭桿菌門為膽汁中的優勢細菌類群，厚壁菌門、放線菌門及擬桿菌門為糞便樣本中的優勢細菌類群；膽固醇結石組膽汁及糞便樣本中Roseburia相對豐度均顯著低于非膽固醇結石組；且非膽固醇結石組糞便樣本中Sporococcus相對豐度顯著高于膽固醇結石組。由此可知：膽囊膽固醇結石患者和非膽固醇結石患者的膽道、腸道細菌種類相似，相對豐度存在差異，且膽道和腸道中存在共有的細菌，但由于膽囊膽固醇結石相關細菌具有復雜性，故膽囊膽固醇結石的具體發生機制有待進一步深入研究。