氟苯尼考中間體氟代物含量的檢測方法

王新江(浙江康牧藥業(yè)有限公司，浙江 嵊州 312400)

0 引言

氟苯尼考(Florfenicol)學(xué)名為氟甲砜霉素，屬于當(dāng)前一種較為新型的酰胺醇類抗生素。該藥物由美國公司先靈-葆雅公司在1988年研制成功，是一種獸醫(yī)專用的氯霉素類光譜抗菌類藥物[1]。該藥物雖然由美國公司研發(fā)，但是首次是在日本上市，隨后在挪威上市，藥品名稱為Aquatlor。在1955年，法國引進(jìn)該藥物并將其命名為Nuflor。而我國引進(jìn)相對較晚，在1999年才正式批準(zhǔn)該藥物為國家二類新獸藥。目前，氟苯尼考已經(jīng)在獸醫(yī)臨床方面應(yīng)用較多，主要用于防治細(xì)菌類疾病，例如治療牛呼吸道方面由巴氏桿菌引起的感染、乳腺炎等，家禽類的大腸桿菌和禽霍亂等病癥。但是近年來，隨著世界上禽畜養(yǎng)殖業(yè)的高速發(fā)展，禽畜業(yè)臨床方面的細(xì)菌感染也隨之出現(xiàn)較大的變化，朝著混合及復(fù)雜性方向發(fā)展。為更好的應(yīng)對上述變化，近年來相繼有大量耐氟苯尼考菌株的出現(xiàn)，同時一些氟苯尼考藥物的不規(guī)范使用使得藥物出現(xiàn)較大的毒性[2]。因此有必要研究一些新型的制劑技術(shù)，改善當(dāng)前氟苯尼考藥物性能。

綜合近些年的相關(guān)研究可知，國內(nèi)外都開展關(guān)于氟苯尼考及其代謝產(chǎn)物的檢測，尤其是在中間體氟代物的檢測取得一定的成果。為更好的應(yīng)用氟苯尼考，有必要研究其生產(chǎn)過程中相關(guān)問題，從而提高療效與生物利用度。

1 理化性質(zhì)

氟苯尼考的結(jié)構(gòu)式具體如圖1所示，其化學(xué)名為D(+)-蘇-1-對甲砜基苯基-2-二氯乙酰胺-3-氟丙醇，分子式為C12H14Cl2FNO4S，分子量為358.22。氟苯尼考作為一種氟化衍生物，類似于氯霉素，二者同樣不具有硝基，所以同樣具有不會引起畜禽類的再生障礙性貧血[3]。氟苯尼考為白色或者類白色的結(jié)晶性粉末，無臭，極其容易溶解于二甲基酰胺，能夠較好溶解在甲醇，冰醋酸中微融，在水或者氯仿中極微融。

圖1 氟苯尼考結(jié)構(gòu)圖

2 抗菌機(jī)理

氟苯尼考在發(fā)揮抗菌作用時，其主要機(jī)理變現(xiàn)在同70S核蛋白體的50S亞基為目標(biāo)靶點(diǎn)，同該靶點(diǎn)位置的A位實(shí)現(xiàn)緊密結(jié)合，從而有效阻礙了肽酰基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，阻止其肽鏈的延伸，從而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，實(shí)現(xiàn)抗菌效果。細(xì)菌在進(jìn)化過程中，已經(jīng)逐步對氯霉類藥物出現(xiàn)了耐藥性，上述特征的出現(xiàn)主要是和細(xì)菌的耐藥基因有關(guān)[4]。早在1996年就已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了對氟苯尼考耐藥基因pp-FloR的分離鑒定，隨后在2000年和2002年先后發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌的氟苯尼考耐藥基因。從上述發(fā)現(xiàn)成果中，可以看出主要是由于病原細(xì)菌產(chǎn)生了氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，也就是氯霉素和甲砜霉素最為容易誘發(fā)上述情況的出現(xiàn)。

氟苯尼考作為動物專用的抗菌素藥物，在禽畜業(yè)應(yīng)用廣泛，因此當(dāng)前對于應(yīng)用方式和應(yīng)用效果研究較多，但是關(guān)于氟苯尼考的原料生產(chǎn)和制劑生產(chǎn)研究相對較少，尤其是關(guān)于如何有效控制雜質(zhì)殘留方面更是鮮見。對于氟苯尼考生產(chǎn)過程中，原料中及其容易存在一些雜質(zhì)，對于不同企業(yè)而言，由于其工藝和技術(shù)的不同，因此在生產(chǎn)氟苯尼考的原料質(zhì)量方面，也都是略有差異。對于氟苯尼考原料生產(chǎn)，其雜質(zhì)主要包含D-乙酸，甲砜氨，D-乙酯等其他的一些氟代物中間體[5]。這些雜質(zhì)的存在，降低了氟苯尼考在應(yīng)用的有效性，主要是降低了在水溶液中的溶解性，即使在后期采用一定的技術(shù)手段提高藥物的溶解性，但是同時也提高了雜質(zhì)的溶解性，對于氟苯尼考的最大溶解度而言依舊起不了多大作用。因此在實(shí)際應(yīng)用中，即使加倍或者加數(shù)倍使用藥物，由于畜禽飲水的水線末端藥物濃度幾乎保持不變，因此在臨床方面不會出現(xiàn)藥效提升的跡象。在上述雜質(zhì)中，尤其是中間體氟代物，對于氟苯尼考的質(zhì)量影響最為明顯，因此有必要對氟苯尼考的生產(chǎn)進(jìn)行中間體氟代物的檢測，從而衡量當(dāng)前氟苯尼考生產(chǎn)質(zhì)量的合理有效性。

3 關(guān)于氟苯尼考中間體氟代物的含量檢測

目前在國內(nèi)，關(guān)于開展氟苯尼考制劑檢測的方法主要有電位滴定法，紫外分光光度法和旋光法，高效液相、氣相色譜法等[6]。當(dāng)前企業(yè)在開展氟代物含量的檢測中，最為常用的方式就是采用氣相色譜法，該方法將氟代物用乙醇溶解后，直接將溶液進(jìn)入氣相色儀中，檢測氟代物的含量，乙醇溶劑影響氟代物含量計(jì)算，該方法誤差比較大，準(zhǔn)確度較差，檢測時間偏長，對生產(chǎn)的指導(dǎo)意義不理想。因此本文將采用液相方法進(jìn)行研究，以便快速準(zhǔn)確檢測氟代物含量。氟苯尼考的合成一般以D-對甲砜基苯絲氨酸乙酯為起始原料，經(jīng)硼氫化鉀還原反應(yīng)，然后與二氯乙腈發(fā)生環(huán)合反應(yīng)得到環(huán)合物，環(huán)合物再與氟化劑(試劑，F(xiàn)PA)發(fā)生氟化反應(yīng)，得到中間體氟代物，然后再經(jīng)水解脫色、結(jié)晶、離心、干燥、粉碎、混合、包裝得到氟苯尼考產(chǎn)品。氟代物的分子式為C12H12Cl2FNO3S，分子量為340，氟代物的主要成分含量直接影響到后續(xù)生產(chǎn)氟苯尼考的含量與雜質(zhì)殘留。因此，精確及時檢驗(yàn)氟代物含量既能可以指導(dǎo)企業(yè)生產(chǎn)，又可以提升企業(yè)氟苯尼考產(chǎn)品質(zhì)量。

4 實(shí)驗(yàn)部分

4.1 主要儀器

Agilent 1260液相色譜，賽默飛U3000液相色譜儀；C18色譜柱；天子天平；50mL容量瓶。

4.2 主要試劑

色譜乙腈；色譜甲醇；純化水；色譜級三氟乙酸。

4.3 實(shí)驗(yàn)方法

4.3.1 色譜條件

色譜柱：SB-C18 150 nm×5 μm×4.6 μm；波長：223 nm；檢測器：UV檢測器。

流動相A：乙腈；流動相B: 0.075%三氟乙酸水溶液。

流速為 1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量 5 μL。

流動相B配制：取純凈水1 000 mL，加三氟乙酸0.75 mL，混勻，用0.45 μm的水系濾膜抽濾。

流動相梯度分析如表1所示。

表1 方法流動相梯度

4.3.2 實(shí)驗(yàn)方法

稱取氟代物25 mg(精確于0.000 1 g)，置于50 mL容量瓶中，加色譜甲醇溶解并定容至量瓶刻度，搖勻后濾過，取5 μL濾液進(jìn)入液相色譜儀中，記錄色譜峰，按面積歸一法進(jìn)行定量計(jì)算氟代物含量。

5 結(jié)果與討論

5.1 檢測波長的選擇

氟代物用甲醇溶解后，通過紫外波長掃描，發(fā)現(xiàn)氟代物在223 nm處有較大紫外吸收，為此方法確定檢測波長為223 nm，如圖2 所示。

圖2 氟代物光譜掃描曲線圖

5.2 流動相的選擇

分別使用不同比例的甲醇、乙腈、水作為流動相，對試樣進(jìn)行分離、色譜峰形條件的選擇，結(jié)果表明，用乙腈與0.075%三氟乙酸水溶液為流動相，并進(jìn)行梯度分析，分離度效果較好，滿足檢測分析要求，且檢測成本低，檢測時間短。典型色譜圖如圖3所示。

圖3 氟代物典型色譜圖

5.3 方法精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取同一樣品的6個平行樣，在上述色譜條件下進(jìn)行平測定，計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)偏差和RSD，6次平行測定結(jié)果如表2所示。

表2 不同氟代物樣品平測定結(jié)果

5.4 專屬性和準(zhǔn)確度測試結(jié)果

精密稱取氟代物5份，每份中加一定量的中間體環(huán)合物，在相同的色譜條件下測定，氟代物與環(huán)合物的分離度符合要求，環(huán)合物的存在不影響氟代物含量檢測，結(jié)果如表3和圖4所示。

圖4 氟代物樣品測試數(shù)據(jù)曲線

表3 氟代物樣品測試結(jié)果表

6 結(jié)語

試驗(yàn)結(jié)果表明，用本方法測定氟苯尼考中間體氟代物含量具有較高的精密度和準(zhǔn)確性，環(huán)合物與氟代物有良好的分離度，該方法操作簡單、快速，是一種較為理想的快速分析方法，便于生產(chǎn)質(zhì)量控制。