靶向溶酶體新型次氯酸熒光探針的合成及性能

杜宇婷，王宏亮，趙三虎，王桂林

(忻州師范學院 化學系，山西 忻州 034000)

0 引言

次氯酸(HClO)，過氧化氫(H2O2)，羥基自由基(HO·)和超氧陰離子自由基被稱為活性氧(ROS)，它們能夠引起細胞內的氧化應激，與許多生理和病理過程相關[1-4]。其中，HClO吸引了很多人的關注，是因為它顯示出關鍵的抗菌特性[5]，以及它在生物、化學、環境及人體免疫防御系統中起著重要作用[6-7]。在生物體內，內源性的HClO是由過氧化氫和氯離子在髓過氧化物酶(MPO)的催化作用下產生[8]，HClO的產生在生物體內是一把雙刃劍。好的一方面，次氯酸能夠保護生物體通過殺死入侵免疫系統中的病原體和細菌[9]。但是，另一方面，越來越多的證據表明，過量的HClO可能會導致蛋白質、核酸和脂質等生物分子被氧化，從而導致組織損傷、炎癥以及一系列疾病，比如炎癥甚至癌癥[10-13]。溶酶體pH值是維持溶酶體正常消化功能的參數，不同原因導致的溶酶體pH值改變可能會影響溶酶體蛋白酶的多種生理過程，進而影響細胞正常功能。因此，基于以上原因，發展一種高選擇性和高靈敏性，用于溶酶體中次氯酸檢測方法具有重要意義。

在過去的幾十年里，傳統的HClO檢測手段比如化學發光法、電化學分析、比色法和質譜法等[14-15]，但是其存在耗時長、操作繁瑣、檢測限低等局限性。由于HClO在人體生理中發揮著重要作用，因此需要設計新的方法來精確的測定體內次氯酸根的含量。與這些傳統的分析方法相比，熒光檢測技術因其易于操作、響應快速和靈敏度高等優點，廣泛應用于生物醫學中[16-17]。近幾年報道有關次氯酸的反應型熒光探針[18-19]，主要是基于次氯酸的強氧化性，比如對席夫堿、不飽和碳碳雙鍵、硫化物、硫縮酮和對甲氧基苯酚的氧化等[20-24]。

2008年，陳課題組報道了利用次氯酸的氧化性，將二苯甲酰肼氧化成羅丹明的二苯甲酰二亞胺[25]。2014年，Goswami 等發現了羅丹明類似物可以用于次氯酸的比率型檢測[26]。2015年，Lee 等報道了一個基于羅丹明和丹磺基部分被次氯酸氧化的熒光探針[27]。2020年，詹和他的同事發現了一個羅丹明螺旋環的一個次氯酸的檢測方法[28]。次氯酸對氟硼類衍生物的氧化也可以用于它的檢測[29-30]。

眾所周知，次氯酸可以把“C=C”和“C=N”氧化斷鍵[16,31]。因此，本文設計并合成了一種以3-(溴甲基)苯甲醛為原料，嗎啉作為溶酶體的靶向基團，分兩步合成了一種檢測溶酶體中次氯酸的熒光探針BMOA(圖1)。研究發現探針BMOA 對次氯酸檢測時具有超快的反應時間(150 s)，高的靈敏度和選擇性。探針對次氯酸的最低檢出限僅為4.13 nmol/L和的特點。因此，本研究為次氯酸的檢測提供了一種簡單且有效的分析方法。高分辨質譜機理驗證表明，熒光探針BMOA的“C=N”被次氯酸氧化而發生斷裂，釋放出MOB，從而使得熒光發生淬滅。

圖1 探針BMOA 對次氯酸的識別機理

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

3-(溴甲基)苯甲醛、N-Boc-1,4-苯二胺、嗎啉購自安耐吉化學劑有限公司；無水乙醇(分析純)、乙酸乙酯 (分析純)、石油醚 (分析純)、二氯甲烷 (分析純)購自天津歐博凱化工有限公司購進；N,N-二甲基甲酰胺從天津市北辰方正試劑廠購進；三氯甲烷從成都市科隆化學品有限公司購進。200～300目柱層析硅膠(青島海洋化工公司)。所用試劑均為分析純，所用去離子水 (≥18 MΩ·cm) 由 Milli-Q 純化系統制備。

SHZ-D(Ⅲ)予華牌循環水真空泵；RE-2000B旋轉蒸發器；GKDL-20小型冷卻水循環裝置；DF-101S型集熱式恒溫磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責任公司)；PHS-3C型pH計(上海雷磁儀器廠)；ZF7三用紫外分析儀(上海予名儀器設備有限公司)；UV-2550型紫外可見分光光度計(日本島津公司)；Bruker AVANCE-600 MHz超導核磁共振波譜儀(德國)；賽默飛高分辨質譜儀；FS5熒光光譜儀(英國)。

1.2 探針BMOA的合成

探針分子 BMOA 的有機合成參考文獻[32]。首先化合物MOB的合成，取原料3-(溴甲基)苯甲醛1.0 g(5 mmol)、嗎啉環0.52 g(6 mmol)和碳酸鉀1.54 g(10 mmol)溶解于適量的溶劑DMF，在70 ℃加熱條件下反應，溶液由無色透明變為黃色，TCL監測，8 h后反應結束。加入40 mL蒸餾水淬滅，用乙酸乙酯萃取三次，減壓蒸餾得到黃色油狀物(溶劑DMF因沸點高無法旋出)，柱層析乙酸乙酯作為洗脫劑，得到黃色晶狀固體1.06 g(5 mmol)產率96.96%。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 10.18, 10.02, 8.25, 7.85, 7.85,7.83, 7.83, 7.82, 7.81, 7.81, 7.80, 7.69, 7.67, 7.67,7.65, 7.65, 7.59, 7.57, 7.56, 7.12, 4.37, 3.60, 3.58,3.57, 3.56, 3.42, 2.42。探針BMOA的合成，取MOB 11.0 g(4 mmol)與N-Boc-1,4-苯二胺1.05 g (5 mmol)溶解于三氯甲烷中，加入催化量的哌啶，在70 ℃回流，TCL監測，12 h后反應結束。加入40 mL水淬滅，CH2Cl2萃取，減壓蒸餾得到黑棕色油狀物，柱層析(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=6∶1)分離，最終得到探針BMOA黃色粉末0.21 g (0.5 mmol)，產率為56.6%。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6), δ 9.43 (s, 1H), 8.63 (s, 1H),7.87 (s, 1H), 7.83-7.77 (m, 1H), 7.51 (d,J= 8.3 Hz,2H), 7.45 (d,J= 7.4 Hz, 2H), 7.29-7.20 (m, 2H),3.58 (t,J=4.5 Hz, 4H), 3.52(s, 2H), 2.38(d,J=5.1 Hz,4H), 1.49 (s, 9H)。13C NMR (100 MHz, DMSO-d6), δ 159.1, 152.8, 147.0, 136.7, 136.4, 132.1, 129.3, 129.2,128.7, 127.8, 121.7, 121.7, 121.6, 119.3, 80.6, 66.9, 63.1,53.7, 53.6, 28.4。HR-MS, C23H29N3O3-，實測值 (計算值),m/z：394.2116[M-H-]-。探針 BMOA 的合成路線見圖2所示。

圖2 探針BMOA的合成路線

1.3 熒光探針BMOA的光譜性能測

在光譜測試前，首先用DMSO溶解探針固體，配制母液為10 mmol/L 探針。再用二蒸水配制10 mmol/L PBS 緩 沖 液 (pH=7.4)及 各 待 檢 測 物 (Cys，ClO-，儲備液(100 mmol/L)。測試時，用移液槍取BMOA的儲備液，使測試的探針BMOA 濃度為5 mmol/L(VCH3CN/VPBS=1∶1)。不同濃度的待檢測物依據實驗需要按照類似的方法取其儲備液進行配制。探針與各待檢測物混合均勻后，室溫振蕩5 min后測試熒光光譜。所用的激發波長為292 nm，激發/發射狹縫寬度為5.0 nm/5.0 nm。響應時間的測定：使用熒光儀測定探針BMOA與次氯酸鈉(120 mmol/L)反應的反應時間。機理驗證的測定：在去離子水的體系中，加入5 mmol/L的探針BMOA，隨后加入24倍當量的次氯酸鈉，反應5 min后利用高分辨質譜分析。

2 結果與討論

2.1 探針分子BMOA對次氯酸鈉的光譜研究

在CH3CN/PBS 緩沖體系(pH=7.4，VCH3CN/VPBS=1∶1)中，如圖3(a)所示，單獨探針BMOA的紫外吸收波長是263 nm和333 nm，當向體系中分別加入不同濃度的 NaClO(50，80，120 mmol/L)后，探針原有的紫外吸收波長消失，在292 nm 處出現新的吸收峰，說明探針確實與次氯酸根離子發生反應，并且有新的物質生成。圖3(b)所示，當向5 mmol/L的探針溶液中加入0～120 mmol/L的NaClO溶液后，探針BMOA 的熒光發射強度在544 nm處逐漸減弱，說明探針與次氯酸根離子發生反應，并且是淬滅型熒光探針。

圖3 圖2探針BMOA對次氯酸鈉的紫外和熒光變化

2.2 探針分子BMOA對次氯酸鈉的滴定實驗和反應時間

為了測試不同濃度的次氯酸根與探針BMOA的相互作用，進行滴定實驗，如圖4所示。隨著次氯酸根離子濃度的增大，F544值在NaClO濃度為0～70 mmol/L呈現良好的線性關系，線性系數為0.997。根據檢出限計算公式(LOD=3σ/k，σ為白樣品連續測定10次的標準偏差，k為標準曲線斜率)[33]，得到方法檢出為 4.13 nmol/L。上述結果說明BMOA可以高靈敏、定量檢測次氯酸。為了探究探針與次氯酸根離子的反應時間，考察了探針BMOA 與次氯酸混合后熒光強度隨時間的變化情況。Figure 2B顯示，反應體系的發射波長在544 nm處快速減弱，150 s后熒光強度基本不再變化。圖4(a)所示為探針BMOA對NaClO的滴定實驗、(b)所示為探針BMOA的熒光強度隨時間的變化關系圖。

圖4 不同濃度的次氯酸根與探針BMOA的相互作用隨時間的變化關系

2.3 探針分子BMOA對次氯酸根離子的選擇性和pH值的影響

在對探針BMOA光譜性能研究的基礎上，進一步評估了探針的選擇性，如圖5所示。加入NaClO響應之后，在最大發射波長544 nm處，熒光幾乎完全淬滅，但是加入其他分析物熒光強度沒有變化。由此證明，探針BMOA對次氯酸根離子具有較好的選擇性。如圖5(b)所示，沒有加入次氯酸根離子時，探針的熒光強度在pH=3～10的范圍內，基本保持穩定，說明探針BMOA在生理pH環境下可以應用。當加入次氯酸根離子后，在pH=5.0～7.5的范圍內，熒光強度的變化不明顯，這說明該探針在生理條件下能夠檢測生物樣品中的次氯酸根離子。

圖5 探針BMOA對次氯酸根離子的選擇性實驗和pH對探針BMOA的影響

2.4 探針分子BMOA對次氯酸檢測的機理研究

為了進一步驗證推測的機理，即探針BMOA被次氯酸氧化釋放MOB(如圖6a是所示)，運用高分辨質譜進行驗證。在去離子水的體系中，加入5 mmol/L的探針BMOA，隨后加入24倍當量的次氯酸鈉，反應之后利用高分辨質譜分析。如圖6b所示，檢測到了MOB的峰(m/z 206.95)，即探針被次氯酸氧化斷裂，釋放出MOB。這為探針BMOA按上述機理進行反應提供了有力的依據。

圖6 探針BMOA對次氯酸根離子的識別機理和與次氯酸鈉反應后的高分辨質譜

3 結語

本文通過利用3-(溴甲基)苯甲醛為原料，嗎啉作為溶酶體靶向基團，設計合成了一種可以檢測溶酶體中次氯酸的熒光探針BMOA。該探針BMOA可以快速靈敏、選擇性地識別次氯酸根離子，并且其熒光信號在0～70 mmol/L次氯酸濃度范圍內呈現良好的線性關系，其檢測限僅為4.13 nmol/L。同時，探針BMOA對次氯酸根離子的響應時間僅為150 s。利用高分辨質譜深入探討了該熒光探針的響應機理即熒光探針BMOA的“C=N”被次氯酸氧化而發生斷裂，從而使得熒光發生淬滅。