嵌合抗原受體T細胞免疫療法治療胰腺癌的研究進展

田靜 張之勇 白天凱 閆濱

1山東中醫藥大學（濟南 250355）；2山東第一醫科大學（濟南 250013）

據每年全球癌癥調查數據發現，胰腺癌患病人數在世界各地都有增高的趨勢［1］。全球每年大約有40 萬人患有胰腺癌，331 000 多人因患胰腺癌死亡，5年存活率小于6%，尤其是在人類發展指數（HDI）高的國家，胰腺癌的發病率、流行率和病死率都比較高［2］。由于許多患者對傳統的治療方法產生了抗藥性，因此迫切需要開發新的有效安全的胰腺癌治療手段。近年來，嵌合抗原受體T細胞免疫療法（chimeric antigen receptor T?cell im?munotherapy，CAR?T）在治療惡性腫瘤中顯示出獨特的優勢［3］，大量臨床試驗數據表明該技術在改善惡性腫瘤患者生存質量以及延長患者生存期方面取得了巨大的成功［4-6］。據不完全統計，國內已有20 余項CAR?T 治療產品正在臨床試驗中，這標志腫瘤治療已進入新時代，CAR?T 免疫療法有望能夠治療癌癥并提高患者生存率。CAR?T 療法是通過提取患者本身T 細胞，在體外進行基因修飾與改造后靜脈輸回患者體內的治療方法。此方法應用患者自體T 細胞，減少了異體免疫攻擊的同時也面臨著T 細胞質量不佳的問題。本文就CAR?T 的基本組成、胰腺癌的熱門靶點及面臨的主要挑戰和進展進行綜述。

1 CAR?T 的基本組成

CAR?T 的核心部件是嵌合抗原受體（CARs），包括腫瘤相關抗原結合區（ScFv 片段）、跨膜區和胞內信號轉導區。其中ScFv 決定CAR 的特異性，胞內信號區域關系著T 細胞活化增殖能力。當ScFv 片段與腫瘤抗原特異性結合時就會刺激胞內信號區域轉導信號從而激活CAR?T 細胞活化增殖并釋放顆粒素、顆粒素酶及IL?2、IL?10 等細胞因子殺傷腫瘤（圖1）。同時鈣依賴性Fas、FasL 殺傷也是T 細胞裂解靶細胞的主要通路［7］。后來研究者們為了提高嵌合抗原分子傳遞信號的強度和持續時間，對CARs 胞內信號區進行改造，包括加入CD28、4?1BB 等共刺激結構域，或添加編碼基因使T 細胞表面表達額外的細胞因子等，CAR?T 從第一代變遷到第四代（圖2），成為了腫瘤免疫治療研究的新熱點。

圖1 CAR?T 細胞殺傷腫瘤細胞的主要機制Fig.1 The main mechanism of CAR T cells killing tumor cell

圖2 CAR?T 的演化Fig.2 The evolution of CAR?T

2 CAR?T 治療胰腺癌的目標抗原

經過研究發現，CAR?T 療法經過近幾年的迭代雖然增強了CAR?T 細胞的增殖能力及殺傷性，但治療效果依然有限。因為CAR?T 細胞并不依賴于樹突狀細胞抗原的處理和遞呈來激活，而是直接與腫瘤細胞表面抗原特異性結合殺滅腫瘤，所以腫瘤特異性抗原靶點的發現是治療癌癥的關鍵［8］。目前上市的5 款CAR?T 產品都是針對血液瘤靶點，其中4 個靶向CD19，一個靶向BCMA。但近幾年學者也探索到了實體瘤的一些相關腫瘤抗原，并在實驗或臨床研究中取得了一定的成果。如胰腺癌細胞表面的間皮素、CD47、EGFR 等抗原表位，為CAR?T 治療胰腺癌提供更多的靶點選擇。

2.1 間皮素（mesothelin）間皮素是通過磷脂酰肌醇區（GPI）錨定在細胞質膜上的糖蛋白。由于其在正常組織中的分布有限而在某些腫瘤組織高度表達，因此有望用于腫瘤的特異性治療［9］。所以研究者們設計了多種靶向間皮素抗原的治療手段如抗毒素、抗體、腫瘤疫苗及過繼性T 細胞等治療，并在臨床前及臨床實驗表現出良好的抗腫瘤效果，顯示了間皮素作為靶點的潛力［10］。賓夕法尼亞大學和諾華公司開發了以間皮素為靶點的CAR?T 療法，在臨床試驗中取得了有效的治療效果。HE 等［11］也構建了靶向間皮素的嵌合抗原受體T 細胞，體外實驗表明，meso?CAR?T 細胞對高表達間皮素和高產IFN?γ 的ASPC1 細胞表現出快速強大的殺傷作用。另外，一項臨床治療也表明間皮素可作為治療胰腺癌的潛在靶點［12］。該治療中心納入3 例胰腺癌患者，在經過靜脈輸入meso?CAR?T 細胞治療后，1 例患者病情穩定且中位生存期延長。

2.2 CD47除了間皮素抗原靶點，有研究發現［13］CD47 是胰腺癌的另一靶點。CD47 是免疫球蛋白超家族的糖蛋白，常在不同類型的血液和實體腫瘤中過表達，在阻斷吞噬、增加腫瘤生存、轉移和血管生成等方面發揮重要作用。CD47 除了作為免疫檢查點抑制劑使用，還有研究［14］成功構建了CD47 CAR?T 細胞，結果顯示在NSG 小鼠腫瘤內注射CD47?CAR?T 細胞后可以顯著抑制BxPC3 胰腺異種移植瘤的生長。人源化CD47?CAR?T細胞還能特異性殺死卵巢、胰腺和宮頸癌細胞系，并產生與CD47表達相關的IL?2因子。因此CD47?CAR?T細胞可以作為一種新型的細胞治療劑用于治療胰腺癌。

2.3 EGFR對于轉移性胰腺癌更難找到合適的靶點，增加了治療的困難性。LIU 等［15］提到在胰腺癌中檢測到了表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）并評估了自體抗EGFR?CAR?T 細胞治療轉移性胰腺癌患者的安全性和有效性并表明EGFR 是一個合理的靶點。一項16 例患者入組的臨床實驗，免疫組化檢測腫瘤細胞中EGFR的表達水平在50%以上后，6 個月內接受1～3 個周期的EGFR?CAR?T 細胞輸注，結果表明腫瘤細胞上EGFR 表達降低且患者病情穩定，轉移性病灶縮小。總之EGFR?CAR?T 細胞治療轉移性胰腺癌是安全有效的。

2.4 其他靶點除了上述研究較多的靶點外，CEA、CEACAM7、MUC1、αvβ6、HER?2/CD24、B7?H3 也具有治療胰腺癌的潛力（表1），為CAR?T 治療胰腺癌提供更多的選擇。但這些胰腺癌表面抗原多數是腫瘤相關抗原，這類抗原在其他正常組織中也可能表達，即在CAR?T 免疫治療過程中會出現“抗原逃逸”等風險，因此尋找新型腫瘤特異性抗原十分重要。有研究表明除了腫瘤表面抗原，胞內也存在許多特異性抗原，開發胞內抗原為減少“脫靶”現象提供了研究方向。另外，在輸注CAR?T 細胞治療前，采用單克隆抗體預先封閉正常組織低表達的靶抗原，也能減少后續治療中的脫靶現象及細胞毒性［22］。因此，雙靶點或多靶點也是CAR?T進化的重要方向。

3 CAR?T 治療胰腺癌存在的挑戰

CAR?T 作為跨時代的治療手段，具有強大的腫瘤殺傷活性，安全性問題一直是關注的焦點。除了“抗原逃逸”等風險，腫瘤微環境的抑制、細胞因子釋放綜合征及CAR?T 細胞衰竭等挑戰也阻礙其治療的有效性。針對這些問題，各界學者們都在努力尋找可行的解決策略。

3.1 腫瘤微環境的抑制及解決策略實體瘤基質細胞中含有大量的腫瘤相關成纖維細胞，這些細胞通過分泌膠原蛋白，形成致密的腫瘤組織，導致腫瘤內間質壓異常升高，形成阻擋CAR?T 細胞浸潤的物理屏障［23］，另外實體瘤分泌的一些趨化因子如CXCL12 和CXCL5 也會阻礙CAR?T 細胞殺滅腫瘤。因此可通過改善CAR?T 細胞浸潤來逆轉免疫微環境抑制，提高CAR?T 免疫療法在實體瘤中的療效［24］。在提高CAR?T 細胞浸潤方面，一研究團隊［25］在CAR?T 細胞中加入了一個基因開關，將這些基因改造過的T 細胞精確地送入腫瘤微環境中，然后在小鼠腫瘤的部位用激光脈沖照射，提高溫度到40～42 ℃激活基因開關，增加抗癌蛋白質表達。這突破了腫瘤微環境的抑制并預防腫瘤復發。KAVANAGH 團隊［26］利用可逆滲透技術實現細胞內物質的快速遞送，該技術通過精確控制目標細胞與含有目的物質的溶液接觸，實現細胞內輸送和隨后的細胞通透性逆轉。另外，Y?mAbs 公司研發一種靶向GD2 抗原的人源化單克隆抗體naxitamab，它可通過與腫瘤表面的GD2 抗原結合，觸發抗體介導的細胞毒性反應并激活免疫系統中的補體系統，臨床前數據顯示它有助于CAR?T 逆轉細胞腫瘤微環境的免疫抑制。這些數據都顯示通過輔助手段可增加CAR?T 細胞與腫瘤細胞表面抗原的結合，減免微環境抑制。但是控制腫瘤增長的蛋白大多數在細胞核內，探索胞內特異性抗原仍是一個巨大的挑戰。

3.2 細胞因子釋放綜合征（CRS）及解決策略CRS是在CAR?T 治療過程中，T 細胞活化產生的多種細胞因子，如IL?6、IL?10 等瞬間大量釋放所引起的免疫刺激和炎癥反應［27］。目前靶向CD19、BCMA 和CD22 的CAR?T 細胞療法都出現過嚴重的CRS［28］。對此在CAR?T 基因中插入一個“可控基因”則可有效避免細胞因子風暴的發生。目前胰腺癌治療仍處于臨床前或臨床初期實驗中，在經CAR?T 治療后如何避免細胞因子風暴仍是極大的挑戰。

3.3 CAR?T 細胞衰竭及解決策略CAR?T 在血液瘤中取得了一系列突破性進展，但對實體瘤始終存在瓶頸。非抗原依賴性的激活為CAR?T 衰竭的主要原因，這也成為CAR?T 攻克胰腺癌的主要優化方向。如有研究者構建雙鏈嵌合受體STAR，其整合了CAR?T 的抗原識別與TCR 活化通路，比CAR?T 細胞具有更高的抗原敏感性，改善了T 細胞的持久性從而有望治療胰腺癌［29］。另外WEBER團隊［30］發現可以通過表觀遺傳重塑讓衰竭CAR?T細胞重獲其功能。

4 創新CAR?T 聯合療法

面對CAR?T 治療存在的眾多阻礙，除針對CAR?T 本身進行優化外，還可通過CAR?T 療法聯合其他藥物或方法來增強殺滅胰腺癌的能力。

4.1 CAR?T 可與免疫檢查點抑制劑聯合治療早期治療胰腺癌時，學者們都只是一味增強T 細胞活性，80年代后期研究者們才逐漸認識到T 細胞抑制性通路在T 細胞活化的同時也同樣被激活。而免疫檢查點抑制劑能以單克隆抗體抑制劑的形式來阻斷這些抑制性信號通路，激活全身免疫、增強T 細胞活性，從而抑制腫瘤生長，最終達到消滅腫瘤的目的［31］。因此檢查點抑制劑能夠阻斷抑制信號通路、活化CAR?T 細胞的增殖能力，進而發揮協同作用避免抗原逃逸，增強CAR?T 細胞的靶向性及殺滅腫瘤的活性。如YANG 團隊［32］利用嵌合抗原受體T 細胞聯合免疫檢查點抑制劑PD?1/PD?L1 治療胰腺癌，結果顯示在體外能有效識別和清除80%的過表達PD?L1 的腫瘤細胞。CHONG 等［33］也曾報道一例難治性彌漫性B 大細胞淋巴瘤在經CD19?CAR T 治療后無反應，但在聯合派姆單抗治療后CAR?T 細胞活性大大增強且患者癥狀得到緩解。美國癌癥協會也曾提出，CAR?T 細胞治療與免疫檢查點阻斷療法聯合使用可有效治療實體腫瘤，同時GROSSER 等［34］指出目前單獨使用免疫檢查點阻斷療法治療胰腺癌等間皮瘤均效果不佳。這些結果均為CAR?T 細胞療法與檢查點免疫抑制劑結合使用提供理論依據。

4.2 CAR?T 與溶瘤病毒聯合治療溶瘤病毒（on?colytic viruses，OVs）可選擇性地感染腫瘤細胞，并在細胞內大量復制并最終裂解細胞且能擴大免疫細胞在腫瘤組織內的浸潤空間［35］，這為OVs 聯合CAR?T 療法突破胰腺癌免疫微環境提供了后續研究思路。經過基因改造后的OVs 在進入腫瘤細胞后，可進一步分泌細胞免疫因子，激活機體自身免疫系統，靶向殺傷腫瘤細胞。如呼腸弧病毒、HSV病毒、溶瘤腺病毒等都能作為攜帶編碼的基因片段的載體伴隨CAR?T 進入腫瘤細胞中，以此裂解胰腺癌細胞的細胞外基質，改善胰腺癌的免疫微環境，增加腫瘤細胞暴露被殺傷的概率且對胰腺癌的轉移有一定的抑制作用。與其他病毒載體相比，溶瘤病毒具有宿主范圍廣、與人類基因同源、不致插入宿主基因突變的優點，亦可作為構建CAR?T 時的病毒載體。其中一研究團隊［36］發現一種溶瘤病毒OV19t 和CD19?CAR?T 產生強大的協同效應，廣泛殺死癌細胞。因此，弱致病性病毒的使用或許可改善CAR?T 治療胰腺癌的腫瘤微環境，為研究者們提供更多的思路。

4.3 CAR?T 與其他藥物聯合治療一些常見中藥或單體如人參皂苷、香菇多糖、靈芝多糖、豬苓多糖等可通過調節細胞因子或直接阻斷、下調PD?1/PDL1機制來抑制腫瘤細胞增殖與遷移侵襲，CAR?T療法與抗腫瘤藥物聯合使用可增強免疫細胞與腫瘤細胞表面的特異性抗原或相關抗原結合的能力，甚至完全浸潤到腫瘤內部治療癌癥。另外一些抗腫瘤藥物或化療藥物可輔助CAR?T 療法治療胰腺癌［37］。治療性癌癥疫苗也可通過特異性誘導T 細胞殺滅腫瘤，成為癌癥治療中的關鍵突破。一些研究發現［38］，針對腫瘤的雙特異性CAR?T 細胞和針對強免疫原性的內源性T 細胞受體，在用免疫原性疫苗免疫后顯示出強大的擴增能力和抗腫瘤活性，如基于巨細胞病毒（CMV）疫苗與CAR?T細胞相結合可協同促進腫瘤清除。在多種小鼠模型實驗中接種表達gp100 的病毒疫苗可增強T 細胞擴增和腫瘤消退。

5 展望

除了CAR?T 治療方法外，有研究表明TCR?T和CAR?NK 在癌癥中取得了實質性突破，認為TCR和CAR?NK 能夠識別更大范圍的潛在腫瘤特異性抗原或能增強殺滅腫瘤效果［39］。大量實驗表明在提供相同數量的細胞時，TCR?T 細胞和CAR?NK 細胞殺滅腫瘤的作用更強。因此使用TCR?T、CAR?NK 細胞或許可解決CAR?T 療法面臨的部分困難。另外鑒于目前CAR?T 細胞治療的成功和CAR?NK細胞療法的潛力，研究人員又把目標放在了具有吞噬外源微生物的單核巨噬細胞上，前期實驗表明CAR 巨噬細胞（CAR?M）在治療實體瘤上具有極大的研究潛力。目前已有兩個基于CAR?M 策略的臨床試驗已獲得FDA 的批準，這為胰腺癌的治療提供了另一種研究思路。相信隨著一代又一代CAR 的改良，胰腺癌等實體瘤的根除指日可待。