血紅蛋白Ube?2復合CD37雜合子異常血紅蛋白的分子診斷及其家系分析

陳晴晴 冼嘉嘉 王燕超 何健淳 何文智 李少英 黎青

廣州醫科大學附屬第三醫院婦產科，廣東省重大疾病重點實驗室（廣州 510150）

地中海貧血（簡稱“地貧”）是最常見的單基因遺傳病之一，世界范圍內大約有5%的人群有異常血紅蛋白病，其中2.9%是地貧引起的。每年約有300 000～400 000 例異常血紅蛋白疾病的嬰兒出生［1］。在中國，地貧存在地區差異性分布，其中以“兩廣”及海南為高發區，廣東省α 和β 地貧的人群基因攜帶率分別是8.53 %和2.54 %［2］。由于地貧的疾病特點為小細胞、低色素貧血，因此地貧基因攜帶者或患者常伴有血液學指標的改變。異常血紅蛋白會導致貧血等癥狀，嚴重的貧血會引起胎兒的發育異常。比如目前已知的巴氏水腫胎、胎兒重度β 地貧等，在臨床上是建議終止妊娠的。所以對于南方地區，特別是廣東、廣西及海南的人群進行地貧篩查尤為重要。人群篩查的目的主要是確定夫妻雙方生育后代患嚴重地中海貧血的風險［3］。周艷潔等［4］通過觀察對比分析大人群地中海貧血篩查的方法發現通過紅細胞平均體積篩選出陽性人群做血紅蛋白電泳，再針對電泳結果做α 地貧基因檢測的方法在人力、經濟、干預地貧胎兒效果上更有優勢。

臨床上篩查地貧的常用方法是血液樣本檢驗，地貧相關的血液檢驗指標包括：血紅蛋白、平均紅細胞體積（MCV）、平均紅細胞血紅蛋白（MCH）、血紅蛋白A2（HbA2）等。MCH 及MCV 是最常用的指標，若MCV 小于80 fL 和/或MCH 小于27 pg 表明篩查結果陽性［5］，需進行HbA2 檢測判斷患者是否為β?地中海貧血攜帶者［6］。HbA2 值高于3.4%～3.6%被認為是β?地貧攜帶者，可通過DNA 基因分析進行明確診斷［7］。在一些情況下，比如α?地貧合并β?地貧，MCV 可以處于臨界范圍，HbA2 在正常范圍，這可能是因為兩種地貧之間存在相互作用。

地貧的診斷需要結合血液學表現、血紅蛋白電泳及DNA 基因分析［8］，對于臨床上可疑的血液指標結果需要進一步行地貧基因診斷。地貧基因診斷方法目前有常規范圍的地貧基因診斷，包括3種缺失型α?地貧基因突變類型、非缺失型α?地貧基因3 種常見突變類型和β?地貧基因17 種常見突變類型。但是這種常規的α、β 地中海貧血基因檢測方法僅能覆蓋約95%的地貧基因缺陷，仍有5%左右的其他型別未能覆蓋。所以對于常規檢測方法檢測不出的基因類型，需進行DNA 測序方法進一步診斷。

隨著基因檢測技術的發展，越來越多未知的地貧基因類型被發現。血紅蛋白Ube?2（Hb Ube?2）就是被發現的罕見型別之一。Hb Ube?2 首先由MIYAJI 等［9］在日本發現，1981年日本IUCHI 等研究者報道了日本第2 例Hb Ube?2（α68［E?17］ASN→ASP），其α 鏈N 端第68 位的門冬酰胺被門冬氨酸所替代（α68Asn→Asp）。Hb Ube?2是廣東省較常見的三種α?珠蛋白變異體之一［10］，國內首次報道的Hb Ube?2 是在廣東省湛江發現的。在對深圳地區異常血紅蛋白病的調查研究中，深圳地區20 734例篩查樣本中發現1 例Hb Ube?2 復合CD118 雜合子異常血紅蛋白［11］，可見Hb Ube?2 型異常血紅蛋白類型的罕見。

在現存的文獻中還未發現有Hb Ube?2 復合CD37 雜合子異常血紅蛋白的相關報道。本文先證者的異常血常規結果與未檢測出地中海貧血類型相矛盾，患者的血紅蛋白、MCH 及MCV 都低于正常值范圍的下限，為輕度貧血，患者的HbA2（%）顯著升高，這引起了筆者的關注，并進一步對其家系進行DNA 基因測序，以望找到患者血常規結果異常的病因及其分子遺傳特點，并評估后代發生重度地貧的風險。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取該家系三代成員，先證者、先證者之妻、先證者之父、先證者之母、先證者之子、先證者之弟、先證者之弟媳、先證者之侄女共八個成員。

1.2 常規方法檢測地貧基因型

1.2.1 儀器及試劑血細胞分析儀（NX?9000，Sys?mex，日本），全自動毛細管電泳儀（Capillarys 2 Flex Piercing，Sebia，法國），離心機（Eppendorf 5240，德國），PCR 擴增儀（ABI9700，美國），凝膠成像分析系統（Bio?rad，美國），水平電泳槽及電泳儀（Bio?rad，美國），恒溫水浴箱。全血基因組DNA 提取試劑盒（QIAGEN，德國），地貧基因檢測試劑盒購于亞能生物技術（深圳）有限公司，試劑均為廠家原裝配套試劑。

1.2.2 血紅蛋白電泳嚴格按照全自動毛細管電泳儀（Capillarys 2 Flex Piercing）的說明書進行操作，分析樣本各血紅蛋白組分的含量。

1.2.3 基因型分析以DNA提取試劑盒（QIAGEN，德國）提取基因組DNA。采用跨越斷裂點PCR（gap polymerase chain reaction，Gap?PCR）技術檢測3 種缺失型α?地貧基因突變類型（??SEA、?α3.7 和?α4.2），采用PCR?反向點雜交法（PCR?reverse dot blot，PCR?RDB）技術檢測非缺失型α?地貧基因3 種常見突變類型（ααWS，ααCS 和ααQS）和β?地貧基因17 種常見突變類型CD41?42、IVS?2?654、?28、CD71?72、CD17、βE、CD31、27/28、IVS1?1、CD43、?32、?29、?30、CD14?15、CAP、Int、IVS1?5），所有地貧基因診斷試劑盒均來源于亞能生物技術（深圳）有限公司。

1.3 DNA 測序地貧基因檢測方法

1.3.1 基因組DNA 提取采用Qiagen 法提取全血基因組DNA，Thermo 公司的NANODROP 2000 紫外分光光度計測定DNA 濃度和純度。

1.3.2 引物設計共設計3 對引物，擴增7 種異常Hb，具體引物序列見表1。

1.3.3 聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增PCR 擴增試劑來自亞能生物技術（深圳）有限公司，總反應體積為50 μL。α1、α2 測序擴增反應條件為96 ℃預變性5 min，98 ℃變性45 s，65 ℃退火1 min30 s，72 ℃延伸3 min，共35 個循環，最后72 ℃延伸10 min；β 測序擴增反應條件為95 ℃預變性5 min，96 ℃變性1 min，65 ℃退火45 s，72 ℃延伸3 min，共35個循環，最后72 ℃延伸10 min。擴增完成后，取5 μL 產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳30 min。

1.3.4 DNA 測序將PCR 擴增產物純化后行雙向DNA 測序（Sanger 雙脫氧末端終止法）。測序圖采用Chrome 軟件進行分析，并與Genbank α?珠蛋白基因（NG000006.1）和β?珠蛋白基因（NG000007.3）進行比對。同時與異常血紅蛋白及地貧數據庫（http：//globin.bx.psu.edu/hbvar/menu.html）進行比對分析。

1.4 血細胞分析采用血細胞分析儀進行血細胞分析，送檢樣本在4 h 內完成檢測。主要觀察指標為血紅蛋白、MCV、MCH。

2 結果

2.1 地貧基因檢測結果先證者及其家系成員的地貧基因檢測結果，見表2。

表2 先證者及其家系成員的地貧檢測結果Tab.2 Test results of thalassaemia of the proband and his family members

2.2 DNA 測序結果先證者、先證者之父親的DNA 測序結果，見圖1。

圖1 先證者、先證者之父親的DNA 測序結果Fig.1 DNA sequencing results of the proband and his father

2.3 血常規檢驗結果先證者及其家系成員血常規檢驗結果，具體指標見表3。

表3 先證者及其家系成員血常規檢驗中血紅蛋白、MCV、MCH、HbA（%）、HbA2（%）、血紅蛋白12 區（Hb Zone12）的結果Tab.3 Results of hemoglobin，MCV，MCH，HbA（%），HbA2（%）and Hb Zone12 in routine blood tests of proband and their family members

3 討論

本文先證者的血紅蛋白、MCH 及MCV 低于正常范圍的下限，通過臨床上常規檢測地貧的方法基因測序，通過對先證者及其家屬的測序結果分析，進行以下討論。未發現異常。但是患者HbA2（%）的數值明顯升高，提示患者很有可能存在beta 地貧基因的異常。通過對患者及其家屬進一步DNA 測序發現患者為Hb Ube?2 雜合突變復合CD37 雜合突變，為罕見的異常血紅蛋白類型。筆者對臨床檢驗異常的結果給予了重視并進一步分析，認為患者存在異常血紅蛋白的可能性很大。而且這種異常血紅蛋白的存在與患者的血常規檢驗結果異常是否相關，其家系遺傳特點及其血液學表現對后代是否產生影響尚不清楚。因此筆者對患者及家屬進行了DNA

在對家系結果分析的過程中，發現先證者之弟及先證者之子均為Hb Ube?2雜合突變，兩人均發育正常，血常規無明顯異常，MCH 及MCV 在正常范圍內。國內有少許關于HB Ube?2 的報道，在廣東省珠海市婦幼保健院的6 297 份樣本中，篩查出2 例Hb Ube?2 異常類型［12］。HUANG 等［13］報道了1 例Hb Ube?2 異常類型，并表示其對患者的臨床表現無明顯影響。根據目前已報道的HB Ube?2 異常血紅蛋白患者血液學表現，結合本文先證者之弟及先證者之子的血液學表現，說明單純的Hb Ube?2 雜合突變對患者的血常規沒有產生明顯影響。

CD37 雜合突變為beta 基因密碼子37 的無義突變，由于β?珠蛋白肽鏈的生物合成完全被抑制，構成血紅蛋白的α?珠蛋白肽鏈和β?珠蛋白肽鏈的平衡被破壞，使得正常血紅蛋白合成減少或者無法合成［14］。CD37 突變包括CD37（TGG>TAG）和CD37（TGG>TGA）兩種。在中國人群中相對較常見的是CD37（TGG>TAG），國外偶有CD37（TGG>TGA）的報道。在來自于巴勒斯坦地區的β 地貧的分析中報道了1 例CD37（TGG>TGA）突變［15］。CD37 雜合突變的發生率低，在一份對泉州11 668 例地中海貧血病例調查中發現CD37 雜合突變的病例只有2 例，占整個調查病例的0.14%［16］。其臨床表現為β0 地貧，為輕型的β 地貧臨床特征，MCH 及MCV 降低，HbA2（%）的數值升高，與本文的先證者及其父親的臨床表現一致。秦丹卿等［17］對12 例CD37 突變陽性的病例進行分析發現其HbA2 均升高。目前還沒有CD37 純合突變的報道。根據李育敏等［18］報道的一罕見β 地貧基因CD37（TGG→TAG）突變復合ɑ 地貧家系的檢測結果提示MCH及MCV 降低，HbA2 升高，與本文的β0 地貧臨床表現同樣符合。

先證者DNA 測序結果其為Hb Ube?2 雜合突變復合CD37 雜合突變，通過對比其父母的結果發現其突變來源于其父親。先證者及其父親的MCH及MCV 均低于正常值范圍的下限，為輕度貧血。兩者的HbA2（%）的數值明顯升高，測序結果驗證了筆者最初的考慮，兩者均合并了β?地貧類型。目前還未有Hb Ube?2 雜合突變復合CD37 雜合突變相關的報道。在研究過程中，還發現先證者之侄女為Hb Ube?2/SEA 地貧類型，屬于α 地貧的SEA 缺失合并Hb Ube?2 雜合突變類型。目前還未發現有與此相關的報道。其血紅蛋白、MCH 及MCV 都低于正常值范圍的下限。對比上文討論的單純的Hb Ube?2 雜合突變對MCH 及MCV 無明顯影響，Hb Ube?2/SEA 地貧類型及Hb Ube?2 復合CD37 雜合突變對MCH 及MCV 有一定的影響，這與文獻報道的結果相一致。在一份對江蘇省無錫地區異常血紅蛋白病的流行病學調查報道中發現的1 例Hb Ube?2 雜合突變，其血紅蛋白及MCV 在正常范圍［19］。

Hb Zone 12 區域是在毛細管電泳中出現的峰，PANYASAI 等［20］在罕見的Hb 沈陽［α26（B7）Ala→Glu，HBA2：c.80C>A（or HBA1）］變異體研究中報道了攜帶此變異體的在毛細管電泳中會出現Hb Zone 12。在RECASENS 等［21］報道的新血紅蛋白變異體中，通過毛細管電泳發現Hb Zone 12 出現的峰值占整個血紅蛋白的3.3%。在我國也有相關的報道，胡帥等［22］報道的四川1 例Hb J Bangkok 基因突變中，通過毛細管電泳方法發現異常的Z12 區域峰，此會影響蛋白質的物理性質，但是不會改變血紅蛋白的功能。結合本文報道的在Hb Zone 12區域出現的峰可以發現，在毛細管電泳中出現Zone 12 區域峰，很有可能存在罕見的異常血紅蛋白，需要進一步驗證其類型，至于存在的異常血紅蛋白是否影響患者的血液系統，還需結合患者的血液指標進行分析。

本文先證者常規地貧檢測結果未有異常與先證者異常的血常規結果相矛盾，因此從這點著手對先證者的家系進行了DNA 測序分析。測序結果解釋了先證者血常規結果異常的原因，通過對家系DNA 測序結果的分析，并進行文獻查找，進一步發現Hb Ube?2 雜合突變復合CD37 雜合突變類型對血常規的影響趨勢與單獨的CD37 雜合突變類型一致。CD37 雜合突變類型對血紅蛋白合成的影響機制與Hb Ube?2 雜合突變復合CD37 雜合突變類型的影響機制是否一致目前還不清楚，有望在接下來的研究中進一步探究。但是對于臨床上血液檢測有異常改變的患者，還是需通過分子診斷的方式進一步確診，這在產前診斷和婚育指導上有重要意義。