漢族與藏族健康人群腸道菌群結構的差異

毛明慧 牛玥 陳春 李樹春

1中央民族大學藥學院，民族醫藥教育部重點實驗室（北京100081）；2海西州天峻縣織合瑪鄉衛生院（青海天峻817200）

人類的消化道內居住著許多微生物，胃腸道擁有最多數量和最多種類的微生物［1］，總數估計在1013～1014［2］。腸道微生物群組成和功能的改變可以改變腸道通透性、消化和代謝以及免疫反應［3］。腸道菌群失衡可能導致許多疾病的發生，包括胃腸道疾病［4］、代謝性疾病［5］以及免疫［6］和精神疾病［7］。因此，腸道菌群在維持人類健康方面發揮著重要的作用。

由于遺傳背景、飲食、文化習慣和社會經濟等多種因素，人類腸道微生物群差異很大，不同種族或地域的人群腸道菌群構成存在差異［8］。其中，種族因素與多種微生物類群、基因家族和代謝途徑密切相關［9］，目前已有多項研究證明不同種族的人群腸道菌群差異較大。DESCHASAUX 等［10］人對生活在同一城市的不同種族人群進行16S rDNA，結果表明地理位置相同的不同種族的人群中腸道菌群組成存在顯著差異。在另一項研究［2］中發現，漢族、藏族和回族學齡兒童腸道微生物群的α多樣性具有顯著差異。LIN 等［11］將漢族與非漢族群體進行分析比較，發現兩個群體具有不同的菌群生物標志物和腸型。

中國是一個多民族的國家，諸多族群在歷史的長河中相互融合、共同發展，形成了現有的56 個民族［12］。一般來說，每個民族都居住在不同的地理位置，并保留著各民族獨特的飲食習慣和生活方式［13］。藏族生活在具有世界屋脊之稱的青藏高原［14］，由于地理上的分離，該地區的居民形成了與漢族人群不同的遺傳背景，以及不同的文化和飲食習慣。因此，藏族和漢族人群適合于研究種族因素對腸道菌群的影響。此外，在現有研究中，有關其他民族與漢族之間的腸道菌群差異的研究較多，而藏族和漢族的腸道菌群差異研究較少。因此，基于種族、微生物群和健康差異之間的相互關系，本論文通過高通量測序和生物信息學分析探討藏族和漢族腸道菌群差異，為從民族角度分析腸道菌群和疾病關系研究提供新的研究思路和實驗支持。

1 資料與方法

1.1 樣本和信息采集 本研究的樣本采集于青海省天峻縣健康志愿者。樣本采集后30 min 內用糞便儲存液保存，干冰運輸到實驗室后，置于-80 ℃冰箱中冷凍保存。納入標準：漢族志愿者三代直系血親均為漢族人群，藏族志愿者三代直系血親均為藏族人群，無胃腸疾病、肝病、高血壓或糖尿病等，近1 個月均未服用任何抗生素或微生物調節劑，遵循其傳統生活方式和飲食習慣。最終納入14 例漢族樣本，28 例藏族樣本。每個志愿者均簽署知情同意書。本研究通過了中央民族大學倫理委員會的批準（批準號：ECMUC2019003CO）。

1.2 DNA 的提取和PCR 擴增 糞便腸道細菌DNA 的提取按照細菌基因組DNA 提取試劑盒MN NucleoSpin 96 Soi 使用說明進行操作。通過兩步建庫法，以DNA 為模板，設計帶接頭的引物進行PCR，利用PCR 產物為模板再次進行PCR。PCR體系（20 μL）為：純化產物5 μL，MPPI-a 2.5 μL，MPPI-b 2.5 μL，2×Q5 HF MM 10 μL。反應條件為：90 ℃30 s，98 ℃10 s，65 ℃30 s，72 ℃30 s，72 ℃5 min，10個循環。將PCR 產物根據電泳定量結果，按質量比1∶1 進行混樣。混樣后，采用OMEGA DNA 純化柱進行過柱純化。1.8%的瓊脂糖凝膠，經過電壓120 V 的電泳40 min 后，切膠回收。最后使用Hiseq2500 上機測序。

1.3 生物信息學分析 測序得到的原始圖像數據轉化為序列數據，存儲為fastq 文件格式。使用QIIME 軟件對序列數據進行過濾，得到Clean tags，并構建稀釋性曲線。使用USEARCH 得到用于后續分析的Final tags，并生成OUT豐度表使用CD-HIT軟 件（http：∕∕www.bioinformatics.org∕cd-hit∕，Version 4.6.6）去除冗余，相似性閾值設置為90%，覆蓋度閾值設置為90%，獲得非冗余基因集。生成Alpha多樣性表，使用R 語言ggplot2 包做盒型圖。通過R 語言的vegan 包基于unifrac 距離進行β 多樣性分析，進行組間Adonis 分析，檢驗組間β 多樣性差異。通過R 語言的DESeq2 包和edge 包進行組間物種差異分析，利用韋恩圖統計漢族和藏族差異OTU 的交并集情況。使用RDP 注釋方法對OTU 進行物種注釋。使用KRONA 對兩組物種注釋結果進行可視化展示。使用PICRUSt 進行LEfSe 分析并預測代謝途徑，將OTU 表與greengenes 數據庫對照，與KEGG 數據庫進行比對，獲得代謝通路信息。使用STAMP 軟件進行組間代謝通路差異分析，得到兩組間差異有統計學意義（P＜0.05）的代謝通路。

1.4 統計學方法 研究樣本數據均以均值±標準差表示，使用SPSS 軟件的一般線性模型進行多變量分析。使用R 語言vegan 包進行db-RDA 環境因子分析。進行Adonis 分析，分析不同分組因素對樣品差異的解釋度。通過ANOSIM 分析，判斷分組是否有意義。進行MRPP 分析，判斷組間數據差異是否具有統計學意義。用R 語言vegan 包進行微生物環境因子分析，limma 包進行組間差異分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象臨床特征 兩民族之間年齡和體質量指數（BMI）差異均無統計學意義（P＞0.05），說明兩組人群基本特征近似一致（表1）。

表1 藏族和漢族人群基本特征Tab.1 Basic characteristics of Tibetan and Han nationality±s

表1 藏族和漢族人群基本特征Tab.1 Basic characteristics of Tibetan and Han nationality±s

基本特征年齡BMI漢族56.36±6.88 25.77±1.87藏族54.21±3.44 25.19±3.24 P 值0.207 0.692

2.2 漢族和藏族腸道菌群的物種多樣性 14 例漢族樣本每個樣本平均有51 505 條Final tags；28 例藏族樣本每個樣本平均有148 706 條Final tags。測序質量在QIIME 軟件中生成Rank-Abundance 趨向水平直線，表明測序深度足夠，測序數據可用于后續分析。α 多樣性分析是對單個樣本中物種多樣性的分析，用來評價單個樣本中物種的多寡（即豐富度）和各個物種的相對密度（即均勻度）。結果顯示反映樣品中群落豐富度的Shannon 指數和反映群落均勻度的Simpson 指數在兩組間無顯著差異［P（Shannon）=0.97，P（Simpson）=0.30］（圖1）。β 多樣性分析結果顯示漢族和藏族腸道菌群之間差異有統計學意義（P= 0.003，圖2），兩組樣本菌群間的分化程度較高。

2.3 漢族和藏族腸道菌群差異 漢族和藏族共有OTU 497 個，漢族特有OTU 167 個，藏族特有OTU 287個（圖3）。在篩選出的199個差異OTU中，在藏族顯著上調的有164個，顯著下調的有35個（圖4）。注釋到屬水平的差異OTUs 中藏族優勢菌屬有瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、厭氧支原體屬（Anaeroplasma）、變形桿菌屬（Proteobacteria）；漢族優勢菌屬有丁酸蓖麻單胞菌（Butyricimonas）、糞厭氧棒桿菌（Anaerostipes）、小桿菌屬（Dialister）、巨球型菌屬（Megasphaera）、巨單胞菌屬（Megamonas）、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）、梭狀桿菌（Clostridium）、鏈球菌（Streptococcus）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）、薩特氏菌屬（Sutterella）、阿克曼氏菌（Akkermansia）、vadinCA02（圖5）。

圖3 差異OTU 分布韋恩圖Fig.3 Venn diagram of differential OTU distribution

圖4 火山圖Fig.4 Volcano plot

圖5 物種注釋及菌群分布Fig.5 Species annotation and flora distribution

2.4 漢族和藏族人群生物標志物的鑒定 通過貝葉斯網絡分析顯示與民族關系最密切的菌群有6 個，屬水平上有5個，分別是OTU82（Megamonas）、OTU80（Phascolarctobacterium）、OTU74（Megasphaera）；種水平上有3 個，分別是OTU81（copri）、OTU56（stercorea）、OTU167（parainfluenzae）。其中與民族因素正相關的有普氏菌（copri）、糞普雷沃氏菌（stercorea），呈負相關的有副流感嗜血桿菌、巨單胞菌屬（Megamonas）、考拉桿菌屬（Phascolarctobac?terium）、巨球型菌屬（Megasphaera）（圖6A）。通過LEfSe 分析篩選出兩組在屬水平上菌群標志物為假丁酸弧菌（Pseudobutyrivibrio）、琥珀酸弧菌屬（Succinivibrio）、伯吉古菌（Catenibaterium）、小桿菌屬（Dialister）、血尿桿菌（Turicibacter）（圖6B）。

圖6 網絡分析及生物標志物的鑒定Fig.6 Network analysis and identification of biomarkers

2.5 漢族和藏族人群差異代謝通路 兩組的差異代謝通路共有10 個，其中，在漢族組中顯著上調的通路有糖代謝（carbohydrate metabolism）、氨基酸代謝（amino acid metabolism）、脂質代謝（lipid metabolism）、新陳代謝（metabolism）、外源生物降解與代謝（xenobiotics biodegradation and metabolism）。在藏族組中顯著上調的通路有酶家族（enzyme families）、復制和修復（replication and repair）、轉化（translation）、核苷酸代謝（nucleotide metabolism）、萜類化合物和聚酮類化合物的代謝（metabolism of terpenoids and polyketides）（圖7）。

圖7 功能預測分析Fig.7 Functional prediction analysis

3 討論

目前，對影響腸道微生物群的主導因素還不清楚，但已知腸道微生物的形成涉及環境、遺傳、種族和生活方式等因素［15］。已有研究［13］表明，種族因素對腸道菌群的影響顯著。許多常見疾病也與腸道微生物的組成和種族有關［16-17］。中國的藏族和漢族在地理，飲食和遺傳多樣性有很大不同，這種差異會影響整個微生物群的組成。為了證實種族-微生物群假說，基于高通量測序數據，從物種和代謝通路角度較為全面的分析了藏族人群與漢族人群腸道菌群的差異，找到了屬水平上兩組的差異菌群，并通過貝葉斯網絡篩選出與民族因素關聯最密切的菌群。此外，本研究進一步篩選出了兩組間具有顯著差異的生物標志物和代謝通路。

從總體的物種豐度上看，藏族和漢族在門水平上的優勢物種相同，均由擬桿菌門（Bacteroidetes），厚壁菌門（Firmicutes），放線菌門（Actinbacteria），變形菌門（Proteobcteria）組成，這和文獻報道的一致［8］。其中漢族組的變形菌門豐度明顯高于藏族。變形菌門中多數細菌對人體具有致病性，具有這種腸型的人更容易遭受外界病原體的感染［18］。SHIN 等［19］報道了變形桿菌門豐度與人類代謝紊亂、胃腸紊亂、炎癥等的發生發展密切相關，可作為腸道失衡的標記物。

在屬水平上，漢族組擬桿菌屬（Bacteroides），毛螺菌屬（Lachnospira），丁酸蓖麻單胞菌（Butyr?icimonas）、糞厭氧棒桿菌（Anaerostipes）、小桿菌屬（Dialister）、巨球型菌屬（Megasphaera）、巨單胞菌屬（Megamonas）、考拉桿菌屬（Phascolarctobacteri?um）、梭狀桿菌（Clostridium）、鏈球菌（Streptococ?cus）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）、薩特氏菌屬（Sut?terella）、阿克曼氏菌（Akkermansia）、vadinCA02 豐度明顯高于藏族，而副桿菌屬（Parabacteroides），羅氏菌屬（Roseburia），多爾氏菌屬（Dorea），顫螺菌屬（Oscillospira），瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、厭氧支原體屬（Anaeroplasma）、變形桿菌屬（Proteobacte?ria）豐度明顯低于藏族。其中，羅氏菌屬是公認的有益菌［20］，為丁酸產生菌［21］。多爾氏菌屬也是產生丁酸的主要菌［22］。丁酸是短鏈脂肪酸的一種，可通過上調腸上皮緊密連接蛋白的表達，減少脂多糖、三甲胺等有害微生物代謝產物通過血腸屏障，對維持腸黏膜的完整性非常重要［23］。藏族的羅氏菌屬和多爾氏菌屬豐度顯著高于漢族，說明藏族腸道菌群富含丁酸產生菌，這可能與藏族人群居住環境有關。擬桿菌屬可以富集厭氧發酵類群，能夠降解難降解底物，并將復雜多糖轉化為單糖以生產ATP［24］。擬桿菌屬豐度的變化可能與漢藏兩組不同的飲食習慣有關，漢族人群多以碳水化合物為主，而藏族人群飲食習慣以肉類為主，果蔬攝入量較少，脂肪及蛋白質攝入量高于漢族人群［25］。

有文獻［24］報道發現腸道富含阿克曼氏菌的患者具有更好的免疫治療效果，阿克曼氏菌也有助于抑制肥胖和改善酒精相關性肝硬化。熊菲等［26］研究發現雙歧桿菌通過胃腸道途徑可能促進樹突狀細胞的分化、發育、成熟，可能增強樹突狀細胞的腸道免疫作用；在樹突狀細胞分化發育過程中發揮的作用可能也是雙歧桿菌影響機體免疫功能的重要環節。這表明漢族和藏族人群的腸道菌群差異可能導致漢族和藏族人群某些疾病的發病率不同。

本研究通過LEfSe 分析最終篩選出兩組在屬水平上菌群標志物為假丁酸弧菌（Pseudobutyri?vibrio）、琥珀酸弧菌屬（Succinivibrio）、伯吉古菌（Catenibaterium）、小桿菌屬（Dialister）、血尿桿菌（Turicibacter）。在功能和代謝通路分析中，我們發現兩組共有十條差異代謝通路。結果表明，糖代謝、氨基酸代謝、脂質代謝、新陳代謝等代謝通路在藏族組顯著下調。這可能與藏族人群常年生活在高海拔寒冷地區，高脂飲食，新陳代謝慢有關［27］。

綜上所述，本研究結果表明漢族和藏族人群腸道菌群的種屬、基因功能和代謝通路存在顯著差異，意味著在將微生物群差異與疾病聯系的研究中，需要考慮種族差異作為潛在的混雜因素。然而，種族可能是一個混合因素，不同種族間的遺傳、環境和飲食差異都對腸道微生物群的組成有一定影響。此外，不同因素之間存在共同影響。因此，這些結果的進一步研究方向，可能是探索腸道微生物群變化的內外因素，并建立各種潛在因素的相互作用網絡；發現更多微生物族群的生物標記物，從而將其作為健康差異的潛在診斷或治療方法。

本研究還存在許多不足之處，由于臨床所限，納入的樣本量較少，兩組研究對象的男女比例有差異，研究納入的均為年齡大的受試者，缺少年輕受試者。由于16S rDNA 技術的限制，本研究檢測范圍不如宏基因組測序范圍廣。在未來的研究中，將使用更科學的測序技術，在擴大樣本量的基礎上，去除混雜因素后進一步研究民族差異對腸道菌群的影響機制。