ApoE基因多態性與ADMA水平在慢性腎臟病患者中的關聯研究

梅佳慧 婁煥堃 王勛 韓翠敏 李鵬 邢團結 汪明瑯 王怡練

蚌埠醫學院附屬連云港市第二人民醫院心血管內科，連云港 222006

不對稱二甲基精氨酸（asymmetric dimethylarginine，ADMA）是有效的內源性一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）抑制劑，可競爭性抑制NOS，減少一氧化氮（nitric oxide，NO）產生。ADMA 在慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）血液透析患者的血漿中可持續升高［1］，其在尿毒癥患者動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）過程中起著重要作用［2］。載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）作為另一種與AS 有關的多功能蛋白，在膽固醇和三酰甘油的代謝中扮演著重要角色，其與肝臟受體的結合有助于介導血液中乳糜微粒和極低密度脂蛋白的清除［3］。ApoE基因多態性也被認為與心血管疾病（cardiac vascular diseases，CVD）有關，Boerwinkle 等［4］報道在血漿總膽固醇中高達17%的遺傳變異性都可能歸因于ApoE 基因多態性。鑒于ApoE 基因多態性與低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）含量和冠狀動脈疾病風險的相關性［5］，ApoE 基因多態性可能會引起CKD 患者對血管內皮功能障礙和AS 的易感性。本研究的目的是評價ADMA 水平與ApoE 基因多態性在基于腎功能程度分組患者中的相互作用。

資料與方法

1、一般資料

選擇2018年1月至2020年1月在連云港市第二人民醫院心內科、腎內科住院的CKD 患者300 例。根據慢性腎臟疾病流行病學協作（chronic kidney disease epidemiology collaboration，CKD-EPI）公式估算的腎小球濾過率（glomerular filtration rate，GFR）被分為3 組進行對照研究：Ⅰ組GFR ＞60 ml/min，包括腎功能正常患者（86 例），Ⅱ組15 ml/min ＜GFR ≤60 ml/min（119 例），Ⅲ組 GFR ≤15 ml/min或正接受血液透析（95 例）。排除標準：年齡＜18 歲、臨床或實驗室檢測懷疑急性腎衰竭、腎病綜合征、妊娠、惡性腫瘤等。

本研究經連云港市第二人民醫院醫學倫理委員會批準（2017K029）；所有患者均得到研究相關的詳細解釋，并簽署知情同意書。

2、臨床病例資料收集

以臨床評價、全身檢查、檔案審閱及實驗室檢測收集患者資料。基本資料：年齡、性別、體質量指數（BMI）、腰圍、糖尿病史、心血管疾病史（腦血管疾病、冠心病、周圍血管病、充血性心力衰竭等）、他汀是否使用、膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、三酰甘油、肌酐、C反應蛋白等。

3、DNA提取

常規抽取研究對象外周靜脈血3 ml，乙二胺四乙酸鹽（EDTA）抗凝，采用QIAGEN（德國）提供的QIAamp DNA Mini Kit（51304）提取 DNA，并結合 Thermo 公司（美國）NanoDrop 2000 分光光度計，檢測所提取DNA 的純度和濃度。

4、ApoE基因多態性檢測

應用軟件Primer Premier 6.0 設計ApoE 基因檢測位點所在基因片段的擴增引物。先使用Q5 高保真熱啟動聚合酶（NEB）PCR 法擴增基因片段，再采用熒光標記單堿基延伸技術（SNaPshot?Multiplex Kit，ABI）結合毛細管電泳技術進行微測序，檢測結果采用GENEMAPPERID V5.0 軟件進行分析，根據峰的移動位置確定延伸產物對應的SNP 位點，根據峰的顏色確定該SNP位點的基因型。

5、ADMA水平測定

患者入院后禁食12 h，清晨、空腹、安靜平臥10 min，肘靜脈采血3 ml，肝素抗凝，2 500 r/min 離心20 min，離心半徑10 cm，分離上層血清，-80 ℃冰箱凍存，以酶聯免疫吸附雙抗體夾心法（ELISA）檢測ADMA水平。

6、統計學處理

采用SPSS 21.0 軟件進行醫學統計分析，計量資料符合正態分布，采用均數±標準差（）表示，組間比較采用方差分析；計數資料比較采用χ2檢驗。本研究檢驗水準均采用α=0.05，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1、資料特征

300 例患者年齡（61.9±13.1）歲，男性151 例（50.33%），BMI（28.0±5.1）kg/m2，糖尿病 88 例（29.33%），心血管疾病174 例（58.00%）；3 組間糖尿病、冠心病比例及低密度脂蛋白、三酰甘油、肌酐、ADMA 水平比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見表1。

表1 慢性腎臟病患者資料特征

2、ApoE基因多態性在不同腎功能組的分布

ε2等位基因在35例（11.67%）患者中存在，ε3等位基因在287 例（95.67%）中存在，ε4 等位基因在58 例（19.33%）中存在。ε3/2基因型出現在29例（9.67%）患者中，ε3/3基因型213例（71.00%），ε4/2基因型6例（2.00%），ε4/3基因型45例（15.00%），ε4/4基因型7例（2.33%）。ApoE等位基因在不同腎功能分組中分布是均一的（均P＞0.05）。見表2。

表2 慢性腎臟病患者ApoE基因多態性在不同腎功能的分布（例）

3、基于是否腎臟替代治療和存在ε4 等位基因的患者資料特征

接受腎臟替代治療的患者存在ApoE ε4 等位基因比不存在ApoE ε4 等位基因的血漿ADMA 水平明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 基于腎臟替代治療及ε4等位基因分組的慢性腎臟病患者資料特征

4、根據ADMA水平分組的CKD患者資料特征

隨著ADMA 水平的升高，患者的尿酸、肌酐水平逐漸升高，差異有統計學意義（均P＜0.05），見表4。

表4 根據ADMA水平分組的慢性腎臟病患者資料特征

5、ApoE基因多態性在不同ADMA水平的分布

ApoE 等位基因在不同ADMA 水平的分布中差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表5。

表5 慢性腎臟病患者ApoE基因多態性在不同ADMA水平的分布（例）

6、腎臟替代治療患者中ε4 等位基因頻率與ADMA 水平3級的相關性分析

通過logistic 回歸分析，在控制混雜因素及擬合各變量之間相互影響的條件下，得到了ε4 等位基因與ADMA 3 級水平的相關性分析（OR=0.042，95%CI：0.007～0.254，P＜0.001），見表6。

表6 95例慢性腎臟病腎臟替代治療患者中ε4等位基因頻率與ADMA水平3級的相關性分析

討 論

內皮功能障礙被認為是動脈粥樣硬化性血管疾病的早期階段。ADMA 作為CVD 的生物標志物，是NOS 的主要內源性抑制劑，參與了CKD 中AS 的發生。ApoE 基因多態性與AS的相關性，可能增加CKD患者AS的易感性。

本研究結果表明，血漿ADMA 水平升高與GFR 降低相關，ApoE 等位基因在不同腎功能分組中分布是均一的，在不同ADMA 水平分組中分布是不均一的。接受腎臟替代治療的患者存在 ApoE ε4 等位基因比不存在ApoE ε4 等位基因的血漿ADMA 水平明顯降低，而這種差異在腎功能正常或早期CKD患者中并沒有發現。

在本研究中，3 組患者的血漿ADMA 水平隨著CKD 的發展而逐漸升高，ADMA 水平與腎功能有著內在的聯系［6］，是腎臟病進展至終末期（end stage renal disease，ESRD）和病死率的一個強有力的獨立風險因素［7］。ADMA 在一定程度上是經腎臟排泄，其在CKD 中的升高與蛋白精氨酸甲基轉移酶活性的增加也有關，這是參與翻譯后精氨酸殘基甲基化過程的酶家族，也是蛋白質修飾的一種常見機制。此外，CKD患者ADMA的積累也與二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶（dimethylarginine dimethylaminohydrolase，DDAH）活性降低有關，它是ADMA 降解的主要途徑之一，將ADMA 水解為二甲胺和L-瓜氨酸［8］。據估計，人類健康每天生產大約300 μmol ADMA，其中大約250 μmol由DDAHs代謝［9］。

ADMA 是一種內源性NOS 抑制劑，這可能部分解釋了CKD 患者和CKD 動物模型血管舒張功能受損、炎癥升高和血管生成減少現象［10］。ADMA的積累是CKD患者發生內皮功能障礙和CVD的危險因素之一［11］。

ApoE常見的遺傳性等位基因包括ε2、ε3、ε4三種，其中ε3 是人群中最常見的一種亞型，被稱為野生型［12］，ε2、ε4 在人群中少見，被認為是變異型，共有6種基因型，分別是ε2/ε 2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε3、ε3/ε4、ε4/ε4［13］，與 ε2/ε4、ε3/ε3 相比，ε3/ε4、ε4/ε4攜帶者膽固醇、LDL-C最高，ε2/ε3型攜帶者膽固醇、LDL-C水平最低。同時ε3/ε4、ε4/ε4攜帶者HDL-C低于 ε2/ε3［14-15］。與 ε3/ε3 基因型的個體相比，ε2 攜帶者患冠心病的風險低20%，ε4 攜帶者患冠心病的風險稍高［16］。ApoE 具有調節炎癥介質分泌及抵抗氧化應激的作用，其中ApoEε4 等位基因缺乏ApoEε2 和 ApoEε3 抗炎特性，而具有較強的促炎作用，能激活核轉錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB），并釋放較高的促炎分子及較低的抗炎分子［17］。

腎功能異常和ApoE 基因多態性之間的聯系也有相關研究［18］，ε2等位基因是CKD 的遺傳風險因素，并與ESRD 風險增加有關［19-20］，ε4 等位基因可能與較低的糖尿病腎病風險相關［12］；Roussos 等［21］發現 ESRD 病患者的 ε2、ε3 和 ε4 分布沒有差異。在我們的研究中并沒有發現基于腎功能分組，等位基因和基因型分布之間的顯著差異。

當評估腎臟替代治療患者中ADMA 水平和ApoE 等位基因頻率之間的關系時，我們觀察到腎臟替代治療組ADMA水平最高的患者顯示出的ε4等位基因頻率明顯低于ADMA 水平低的患者，即使在校正混雜因素后，這種關聯仍然顯著。這種聯系表明尿毒癥能夠在ε4 等位基因攜帶者中伴有較低的血漿ADMA 水平，ApoEε4 等位基因的表達可能受到腎功能異常等臨床變量的限制，正如我們在研究中所看到的，其機制有待于進一步研究確定。

本研究結果表明，尿毒癥能降低ε4 等位基因攜帶者的血漿ADMA 水平。在腎臟替代治療患者中，ApoEε4 等位基因頻率較低和ADMA 水平較高之間的這種聯系可能表明了一種在尿毒癥炎癥狀態下探討AS 形成的新方法，此類觀察結果的確認需要在更大人群研究的縱向觀察中進行驗證。

我們的研究也存在一定的局限性，這是一項單中心描述性橫斷面研究，另外遺傳分析方法（單核苷酸多態性）在理解基因型-表型界面方面有局限性，這些方法不能同時分析多個基因，阻礙了對多基因疾病遺傳特征的研究。

在以后的研究中我們擬入選更多的CKD患者來驗證較低頻率的ApoE ε4 等位基因與較高水平的ADMA 之間的聯系是否也發生在CKD的早期階段。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突