葛根素對正常小鼠腸道微生物活度及消化酶活性的影響

黃莉莉，譚周進，朱佳源，謝果珍

（1.湖南中醫藥大學中醫學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學醫學院，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208）

葛根素（Puerarin）屬于異黃酮化合物，是葛根的主要藥效成分之一[1]，葛根素藥理活性廣泛，尤其是控制血糖和保護心臟的功效尤為突出[2-3]，同時能改善內質網應激以阻止小鼠胰島素瘤細胞系（MIN6）的凋亡從而有效控制糖尿病患者的血糖[4]；還能通過抑制腎上腺素受體顯著降低腎上腺素引起的高血壓反應[5]。以葛根素為主要成分開發的葛根素注射液[6]、消渴降糖膠囊[7]等聯合西藥治療不穩定型心絞痛和糖尿病的效果顯著。除了以上藥理作用外，葛根素還具備解酒護肝、抗氧化、抗疲勞等保健功效。胡曉陽等[8]用葛花解酲湯灌胃治療醉酒模型小鼠，發現葛花解酲湯能顯著降低其血液乙醇濃度，證明葛花解酲湯有明顯的防醉解酒作用。此外，以葛根素為主要成分開發的抗疲勞口香糖[9]和葛根果凍[10]等保健食品也深受大眾喜愛。

但葛根素脂溶性低，由于其結構中的C—C 鍵不易被小腸中的酶水解，大部分葛根素進入人體后隨糞便和尿液排出，只有少量被肝細胞色素P450 同工酶及結腸微生物分泌的代謝酶代謝為單羥基和雙羥基葛根素，或者還原為大豆苷元和雌馬酚等代謝物[11]。葛根素作為多種代謝酶的活性底物能對機體消化系統進行調節，有研究表明，葛根素可通過改變酶的構象抑制胃蛋白酶和胰蛋白酶的活性[12-13]。然而關于其對正常機體消化系統的影響研究較少。筆者探究了葛根素對正常小鼠腸道微生物活度和消化酶活性的影響，從腸道微生物和消化酶活性的角度分析葛根素對正常小鼠消化系統的作用，以期為相關保健食品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試動物 SPF 級昆明種雄性小鼠12 只，5 周齡，體質量18～22 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[動物許可證號：SCXK（湘）2019-0004]，分籠飼養于湖南中醫藥大學動物實驗中心，日常維持飼料由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供。

1.1.2 儀器與試劑 主要儀器設備有電子天平（JA2003，上海舜宇恒平科學儀器有限公司）、紫外分光光度計（Nano-drop2000/2000C，美國 Thermo Fisher Scientific 公司）、立式壓力蒸汽滅菌器 （SQ510C，重慶雅馬拓科技有限公司）、電熱恒溫干燥箱（202-2AB，天津市泰斯特儀器有限公司）、恒溫搖床培養箱（SH2-82，金壇榮華儀器制造有限公司）、超純水儀（PC 120COBPM1，上海威立雅水處理技術有限公司）、臺式高速冷凍離心機（1850R，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）、渦旋混合器（VORTEX-5，海門市其林貝爾儀器制造有限公司）、三用恒溫水箱（HA-600，金壇市神科儀器廠）。主要試劑有熒光素二乙酸（Fluorescein diacetate，FDA，純度≥97%，上海源葉生物科技有限公司；參考唐圓等[14]的方法配制2 mg/mL的FDA 儲存液，置于棕色瓶中4℃避光保存備用）、葛根素（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）、丙酮（分析純，湖南匯虹試劑有限公司）、氯化鈉（分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司）、磷酸二氫鉀（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）、磷酸氫二鈉（分析純，天津市恒興化學試劑制造有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 將12 只小鼠適應性喂養3 d 后隨機分成常規組與葛根素組，每組各6 只。小鼠適應性喂養3 d 后，參考Jeon 等[15]的給藥劑量，葛根素組小鼠按10 mg/kg 的劑量灌胃，常規組小鼠給予等體積的無菌水，0.35 mL/（只·d），每天1 次，連續15 d。

1.2.2 檢測指標及方法 （1）重量和攝食量。小鼠購回后稱重，即為初始體重，隨后每3 d 進行稱重，同時記錄小鼠的攝食量。（2）糞便收集。連續灌胃15 d 后，將2 組小鼠轉移至干凈籠盒，收集小鼠新鮮糞便，樣品混合收集于已滅菌、內有玻璃珠的離心管中，離心管全程置于盛滿冰的泡沫盒中，立即帶回實驗室，-4℃保存待檢。（3）體重及各臟器稱重。將小鼠禁食12 h 后稱重，然后采取頸椎脫臼法處死，解剖后采集各組小鼠的肝臟、脾臟和胸腺，用濾紙吸干血液后稱重，計算各臟器系數。臟器系數（%）=臟器重量（g）/小鼠體重（g）×100。（4）腸道微生物活度的測定。在裝有小鼠糞便樣品的離心管中加入20 mL（下同）無菌水，于振蕩器上震蕩5 min 使酶液充分溶出，3 000 r/min 離心15 min 后收集上清液即為粗酶液。參考謝果珍等[16]的方法用FDA 法測定粗酶液中微生物活度，每個樣品平行測定3 次。（5）腸道消化酶活性的測定。制備粗酶液方法同前。纖維素酶、淀粉酶和蔗糖酶活性采用DNS 比色法[17-18]分別在540、520、540 nm 測吸光值，蛋白酶活性采用福林酚法[17]在660 nm 測吸光值，然后分別計算酶活性。

1.3 統計學分析

采用SPSS 21.0 軟件進行統計分析。各組測得數據采用平均值±標準偏差（±s）表示，組間數據差異兩兩比較采用獨立樣本t檢驗，檢驗標準α=0.05。

2 結果與分析

2.1 葛根素對正常小鼠攝食量的影響

常規組小鼠的平均攝食量在干預期呈現出一定的波動。葛根素組小鼠的平均攝食量只在干預的7～9 d稍低于常規組，其余時間均高于常規組，尤其在給予葛根素1～3 d 及13～15 d 時攝食量顯著高于常規組小鼠（P＜0.05）。葛根素組小鼠的平均攝食量在葛根素干預后呈現先下降后上升的趨勢，可能是由于小鼠對葛根素的攝入有一個適應期，適應期間稍抑制了攝食量，而機體適應了葛根素的攝入后，攝食量即恢復正常，并隨著小鼠周齡的增加而提高。

圖1 葛根素灌胃處理不同時間小鼠攝食量的變化

2.2 葛根素對小鼠體重的影響

由圖2A 可知，飼養期間2 組小鼠體重均逐漸增加，葛根素組小鼠初始體重較常規組稍重，但各時期2 組小鼠的體重變化無明顯差異。由圖2B 可知，試驗期間2 組小鼠體重增長率均逐漸降低，且葛根素組小鼠的體重增長率較常規組低（t=0.696，P=0.501），說明葛根素的攝入有降低小鼠體重增長率的趨勢，有助于控制體重。

圖2 葛根素灌胃處理不同時間小鼠體重（A）及體重增長率（B）的變化

2.3 葛根素對正常小鼠臟器系數的影響

胸腺和脾臟是重要的免疫器官；肝臟是能量和脂類代謝、蛋白質合成和解毒等重要生命活動的場所；臟器系數能在一定程度上反映動物內臟器官的功能狀態，也被用于藥物的毒性和安全性評價[19]。由表1 可知，常規組與葛根素組小鼠的胸腺指數、脾臟指數及肝臟指數無明顯差異，說明葛根素的攝入對正常小鼠各器官無不良影響。

表1 葛根素灌胃處理15 d 后小鼠臟器系數的變化

2.4 葛根素對小鼠腸道微生物活度的影響

FDA 可被細菌及真菌中表達的非專一性酶催化水解產生熒光素，而微生物活度與FDA 水解酶活性成正比[20]，故通過在體外測定腸道微生物活度能在一定程度上反映微生物的代謝能力。由圖3 可知，與常規組相比，葛根素組小鼠腸道微生物活度顯著降低（t=4.914，P=0.037），說明葛根素攝入后可能抑制了某些微生物的生長或其功能基因的表達。

圖3 葛根素灌胃處理15 d 后小鼠腸道微生物活度的變化

2.5 葛根素對小鼠腸道消化酶活性的影響

由表2 可知，與常規組相比，葛根素組蔗糖酶和蛋白酶活性均升高，但變化不顯著；淀粉酶活性極顯著升高；纖維素酶活性顯著降低；說明葛根素的干預能降低纖維素酶活性的同時升高蔗糖酶、蛋白酶和淀粉酶的活性。消化酶的活性可以反映腸道對碳水化合物和營養物質的消化吸收功能，以上結果說明葛根素的攝入有助于小鼠腸道對蔗糖和淀粉等營養物質的降解，促進機體代謝。

表2 葛根素灌胃處理15 d 后小鼠腸道消化酶活性的變化 （U/g）

3 結論與討論

3.1 葛根素對小鼠腸道微生物活度的影響

以FDA 水解酶的活性高低反映微生物活度的高低最初應用于土壤微生物，課題組已成熟地將FDA法用于評價動物或人體腸道微生物總體活度。該研究中，小鼠攝入葛根素后微生物總體活度顯著降低，可能與葛根素抑制了某些微生物的生長，并進一步抑制其相關酶的表達有關。

3.2 葛根素對小鼠腸道消化酶活性的影響

哺乳動物的腸道是食物和藥物代謝吸收的主要部位，也是眾多微生物寄居的主要場所。腸道微生物群可分泌多種消化酶共同參與腸道中食物和藥物的代謝吸收。藥物與腸道微生物之間存在相互作用。一方面，藥物可影響腸道微生物的組成和功能，從而影響機體酶的活性、數量和豐度；另一方面，腸道微生物及其分泌的酶類又能參與藥物的代謝，從而影響其藥效的發揮[16]。蔗糖是日常食品中的主要糖類，蔗糖酶可水解蔗糖生成果糖和葡萄糖，蔗糖酶主要由小腸絨毛上皮細胞合成分泌，也可由腸道微生物產生[21]，小腸中的淀粉先經胰α-淀粉酶水解為麥芽糖，再被α-葡萄糖苷酶進一步水解成為葡萄糖[22]。淀粉酶和蛋白酶屬于機體自身分泌，而纖維素酶屬于腸道微生物分泌。與常規組比較，葛根素組小鼠蔗糖酶和淀粉酶活性顯著升高，可能是機體對葛根素灌胃刺激的應激反應引起的。由腸道微生物活度數據可知，腸道微生物活度顯著降低，與此同時，由腸道微生物分泌的纖維素酶活性亦顯著降低，故推測葛根素能抑制腸道中表達纖維素酶的微生物的生長。

3.3 葛根素對小鼠體重的影響

以往研究表明，葛根素對不同類型肥胖均有一定程度的治療作用，如Wang 等[23]、Scherer[24]發現葛根素能顯著降低卵巢切除和胰島素抵抗型肥胖大鼠的體重和體脂含量；張玉武等[25]用不同劑量的葛根素對膳食誘導的營養性肥胖大鼠灌胃6 周后，發現葛根素能顯著降低肥胖大鼠的體重、血清甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）和肥胖指數（Lee's）。該研究發現，小鼠攝入葛根素后體重增長率亦有所降低，這與以往研究結論一致。食物在小鼠體內代謝的途徑和效率與消化酶的種類及其活性密切相關[26]，消化酶有助于膳食纖維和營養物質的消化吸收和胃排空，減少未消化食物進入腸腔內的比例，腸道消化酶活性的提高，可以預測消化率的提高[27]。因此，通過調節消化酶的活性促進機體代謝可能是葛根素控制體重的機制之一。

3.4 不足與改進

該研究中小鼠微生物活度變化數據代表的是腸道微生物變化的總體趨勢。而腸道微生物群是一個復雜的系統，存在著數量眾多的細菌和真菌，且可體外培養的微生物只占腸道微生物的小部分，故還需進一步利用高通量測序及酶技術研究葛根素對小鼠腸道微生態的影響，以作綜合分析。