大黃芩魚散半仿生提取及其活性成分的檢測

古瑪納， 姚 丹， 王宏軍， 周麗芹， 博 意， 李虹穎， 張 達

（錦州醫科大學畜牧獸醫學院，遼寧錦州 121001）

從中草藥中最大限度地提取、分離、純化有效物質，盡量減少無效甚至毒性成分，是確保中草藥制劑質量并發揮臨床療效的關鍵。張兆旺、孫秀梅（1995）提出了“半仿生提取法（SBE）”。 經歷二十多年的發展和檢驗，SBE 法既符合中醫藥理論，又是中草藥提取分離技術的革新， 具有較高的學術價值和推廣應用前景。 大黃芩魚散為經典漁用抗菌復方中草藥，收載于《中華人民共和國獸藥典》，主治魚蝦類的爛鰓病。 目前國內外對大黃芩魚散半仿生提取物的系統研究較少， 在其質量評價方法、藥效物質基礎成分、藥理毒理作用及機制方面的研究更加不足。因此，本項研究以最小抑菌濃度為響應值，利用均勻設計 U5（53）安排 3 因素 5 水平實驗， 優選大黃芩魚散半仿生提取物的制備工藝， 為大黃芩魚散抗菌制劑進一步研發和成果轉化奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 大黃、黃芩、魚腥草（亳州市貢藥飲片廠）；濃鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀（天津市風船化學試劑科技有限公司）；胃蛋白酶、胰蛋白酶（上海生工生物工程股份有限公司）；乙腈（天津市津東天正精細化學試劑廠）；磷酸（天津南開大學精細化工股份有限公司）；黃芩苷、槲皮素、大黃素、 蘆薈大黃素 （成都曼思特生物科技有限公司）；鵝沙門氏菌（錦州醫科大學）。

DHG-9245A 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒有限公司）；恒溫培養箱（北京金北德工公司）；雷磁PHS-3C 型pH 計 （上海精密科學儀器有限公司）。 高效液相色譜儀：L-7420（日本日立公司），配四聯泵、脫氣泵、紫外檢測器和柱溫箱；色譜柱：島津 InertSustian C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）（天津市尚亞科技發展有限公司）； 超聲波清洗器：KQ-300B（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 均勻實驗設計 利用均勻設計表U5（53）安排溶媒pH、料液比、提取時間3 因素5 水平的實驗，實際操作方案見表1。 以最小抑菌濃度（MIC）為響應值，優化提取工藝參數。

表 1 U5（53）均勻實驗設計操作表

1.2.2 提取溶媒的配制 按照《中國獸藥典》中收錄的人工胃液（pH 1.5）、人工腸液（pH 6.8）、人工大腸液（pH 8.3）配制方法制備提取溶媒，其他pH溶媒用鹽酸或氫氧化鈉配制。

1.2.3 提取物的制備 按照《中國獸藥典》中收錄的大黃芩魚散處方比例，每組稱取大黃1.08 g、黃芩 0.65 g、魚腥草 0.27 g，按照表 1 開展實驗，每組提取溫度均為37 ℃，每組重復3 次。

1.2.4 MIC 的測定 精確稱取各組提取物浸膏加水溶解配制成濃度為100 mg/mL， 采用徐淑云等（1994） 提出的活菌計數法調整細菌濃度為106cfu/mL，采用 Jiang 等（2013）報道的微孔-平板法測定各組中草藥提取物對鵝沙門氏菌的最小抑菌濃度，重復3 次。

1.2.5 色譜條件 流動相： 乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脫， 有機相洗脫梯度為：0 ～ 23 min，20% ～25%乙腈；23 ～ 29 min，25% ～ 30%乙腈；29 ～ 40 min，30% ～ 35%乙腈；40 ～ 52 min，35% ～ 55%乙腈；52 ～ 56 min，55% ～ 75%乙腈；56 ～ 60 min，80%乙腈；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長260 nm；進樣量 10 μL。

1.2.6 樣品制備 精確稱量各組浸膏0.1 g，加10 mL 甲醇充分溶解，濾液即為待測樣品；另外精確稱取黃芩苷、槲皮素、大黃素、蘆薈大黃素2 mg，加10 mL 甲醇溶解，濾液即為對照品。

1.3 統計學方法 采用SPSS 26.0 版統計軟件進行逐步回歸分析及單因素方差分析，P ＜0.05 表示有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 實驗各組的MIC 表2 顯示各組中草藥半仿生提取物體外對鵝沙門氏菌的MIC 結果，經SPSS 26 版軟件進行逐步回歸分析獲得其線性方程為 Y=12.419-0.384X1+0.136X2-0.67X3，R2=0.91，模型回歸與殘差有顯著性差異（P ＜0.05），表明該模型能夠反映出各因素對MIC 的影響，三種因素對MIC 的影響大小順序為料液比＞溶媒pH＞提取時間，其中料液比為顯著性影響因素（P ＜0.05）。鑒于MIC 越小則抗菌活性越強，則經統計分析獲得大黃芩魚散半仿生提取的最優工藝參數為提取溶媒pH 8.3、料液比1:40、提取時間0.5 h。

表2 U5（53）均勻實驗設計各組的MIC

2.2 HPLC 檢測結果 從最優工藝制備的復方中草藥提取物中可以同時檢測到多種化學成分（圖 1a）， 其中標定了 4 種化學成分為黃芩苷（24.415 min）、槲皮素（33.415 min）、蘆薈大黃素（53.082 min）和大黃素（59.915 min）（圖 1b ～ 圖1e）。

圖1 HPLC 色譜圖

3 討論

傳統中獸藥的應用需要引進新技術， 越來越多的學者在原方基礎上開展中草藥提取物、 新型藥劑方面的研發。 殷明陽等（2015）報道中草藥提取是中草藥生產中相當重要的環節， 傳統的中草藥提取方法主要有煎煮法、浸漬法、滲漉法、回流提取法、連續回流提取法等，且每種方法都有其優缺點。 而SBE 可以通過體外模擬人工胃腸的基礎環境， 提取過程符合口服藥物在胃腸道轉運吸收的特點，提高口服中草藥的適口性。 所以，本項研究開展了大黃芩魚散半仿生提取物制備工藝的研究，參照張兆旺、孫秀梅（2011）報道半仿生提取的溫度一般為 37 ～ 60 ℃，且石瑩瑩（2020）指出，半仿生-生物酶法在中草藥中三萜皂苷類、糖苷類、酚酸類、黃酮類、生物堿類等有效成分的提取中應用研究較多， 所以本研究選擇的提取溫度為37 ℃，但在后續研究中還是有必要進一步探討提取溫度對響應值的影響， 在加入生物酶的體系中設定提取溫度為37 ℃，有利于發揮酶活性；在沒有生物酶的體系中可以嘗試提高提取溫度， 這樣可能會得到更好的結果。 在本實驗HPLC 檢測結果中并未如仙靚等（2018）報道的半仿生－酶法可以提高大黃素的提取率，這可能與實驗中選擇的酶有關。

近年來研究中草藥提取工藝的實驗設計方法多采用正交設計試驗法、 響應面法，Fang 等（2000）報道均勻設計法與正交設計試驗法和響應面法相比，只需要考慮試驗點在試驗范圍內均衡分散，有效避免前者對數據整齊可比性的要求，減少了實驗步驟，具有節約時間和節省耗材的優點。本研究均勻設計法優化結果表明， 在提取溫度37 ℃、提取溶媒 pH 8.3、料液比 1:40、提取時間0.5 h 時，獲得的大黃芩魚散半仿生提取物能更好的抑制鵝沙門氏菌生長。該工藝對儀器要求低，能夠減少提取溶液，有效縮短提取時間，提高抗菌活性，該方法準確可靠。

中草藥成分極其復雜， 在復方中草藥中發揮藥效主要是由各味藥中多種組分共同作用的結果，因此在控制及評價復方中草藥質量時，僅僅圍繞某種或者幾種中草藥材的成分來開展分析，無法準確全面地詮釋中草藥的成分和質量。 陳靜（2021）報道中草藥指紋圖譜技術在中草藥分析中的應用及在中醫藥生產中發揮了積極作用， 促進了中草藥產品質量的提升， 亦可加快產品研發速度，值得拓展，以推動中醫藥行業的快速發展。 大黃芩魚散的含量測定方法在《中國獸藥典》中已有收錄， 僅僅用HPLC 檢測制劑中黃芩苷一種成分的含量。 在本實驗設計的色譜條件下，HPLC 可同時從提取物中檢測到黃芩苷、槲皮素、蘆薈大黃素和大黃素等多種化學成分，圖1a 中未標明的且分離效果較好的化學成分， 擬通過HPLC-MS 聯用設備進一步鑒定、確認，色譜條件還有待于進一步優化并進行方法學考察。

4 結論

以MIC 為響應值， 大黃芩魚散半仿生提取最優工藝為提取溫度37 ℃、提取溶媒pH 8.3、料液比1:40、 提取時間 0.5 h； 在檢測波長為 260 nm 條件下， 以乙腈-0.1%磷酸水為流動相進行梯度洗脫，HPLC 可以同步檢測到大黃芩魚散半仿生提取物中含有黃芩苷、槲皮素、蘆薈大黃素和大黃素。