Q-Exactive 高分辨質譜同時測定生乳中5 類32 種獸藥殘留

高 娃 ， 徐艷偉 ， 王志峰 ， 吳云芳

（1.錫林郭勒職業學院，內蒙古錫林浩特 026000；2.錫林郭勒盟疾病預防控制中心，內蒙古錫林浩特 026000）

生乳中獸藥殘留主要因泌乳期動物使用了獸藥，代謝到分泌的乳中所致。檢測獸藥殘留的方法很多，最常見的是液相色譜（馬巖等，2018；王煉等，2011）、 氣相色譜串聯譜質譜 （農村農業部，2014）、液相色譜串聯質譜（張炯愷，2019；趙維等，2012） 和高效液相色譜串聯高分辨質譜 （馬俊美等，2021；虞成華等，2017；趙鳳娟等，2014）。 多數獸藥殘留檢測方法，是檢測單一種類的獸藥殘留。獸藥在種類、結構、理化性質等方面都存在差異，為了實現多種類同時測定，需要建立快速、高通量的檢測方法，也是目前的趨勢。因此本項目通過優化樣品前處理過程、色譜、質譜條件，結合超高效液相色譜的極高分離技術和Q Exactive Orbitrap HRMS 高分辨質譜技術于一體的檢測方法， 開展生乳中獸藥多殘留高通量檢測技術的研究工作，旨在建立一種同時檢測磺胺類、大環內酯、林可酰胺、酰胺醇、青霉素5 類32 種獸藥殘留的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材 乙腈、甲醇：色譜純，廣州艾欣科學儀器有限公司；甲酸：色譜純，北京邁瑞達科技有限公司；無水硫酸鈉：分析純，東莞市喬科化學有限公司；PSA：40 ～ 63 μm， 北京綠百草科技發有限展公司；C18：50 μm，北京綠百草科技發有限展公司；微孔濾膜：0.22 μm，天津東康科技。

1.2 標準品 磺胺類16 種（甲氧芐氨嘧啶、磺胺二甲嘧啶、琥珀磺胺噻唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺異噁唑、磺胺甲噻唑、磺胺甲氧基噠嗪、磺胺多辛、磺胺甲噁唑、磺胺苯吡唑、磺胺喹噁啉、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶），大環內酯類7 種（羅紅霉素、克拉霉素、乙酰螺旋霉素、地紅霉素、阿奇霉素、泰利霉素、替米考星），林可酰胺3 種（克林霉素、林可霉素、吡利霉素），酰胺醇 3 種（氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素），青霉素3 種（納夫西林鈉、苯唑西林鈉、氯唑西林鈉），均購自天津阿爾塔科技有限公司。

1.3 儀器 Q Exactive 四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜儀（賽默飛世爾科技公司，美國）；漩渦混合器（無錫沃信儀器有限公司）；旋轉蒸發儀（鄭州長城科工貿公司EV-400）；高速冷凍離心機（北京北利時代醫療科技有限公司）。

1.4 色譜條件 色譜柱：Hypersil GOLD 25002-102130 C18；流動相A：0.1%甲酸水；流動相B：甲醇；流速：0.4 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL；沖洗程序：梯度沖洗。

1.5 質譜儀的條件 檢測器：Q Exactive； 離子源：靜電噴霧電離（ESI）源；采集方式：正負離子交換采集；質譜掃描方式：Full MS/dd-MS2。 此處省略了離子源參數和交叉掃描參數。

1.6 樣品前處理

1.6.1 樣品的提取 稱取樣品2 g（精確至0.01 g），置于50 mL 聚丙烯離心管中，加入1%氨水乙腈溶液 15 mL、無水硫酸鈉 5.0 g，渦旋混勻 1 min，4 ℃，9500 r/min 離心5 min， 在另一個 50 mL 離心管中收集上清液。 剩余樣品重新加入15 mL 1%乙酸乙腈溶液，旋緊螺帽，渦旋 5 min，4 ℃，9500 r/min離心5 min， 吸出上清液， 合并待凈化的兩次有機相。

1.6.2 樣品的凈化 在乳樣提取溶液中加入QuEChERS 凈化劑 （100 mg PSA、40 mg C18 和600 mg MgSO4），擰緊螺帽，高速渦旋 1 min，4 ℃，9500 r/min 離心5 min。 取所有有機相溶液，在旋轉蒸發儀上于40 ℃減壓蒸發至近干。 加0.1%甲酸水/甲醇 （V/V，9:1）2.0 mL 溶解殘渣， 渦旋 1 min，通過 0.22 μm 濾膜，上機測定。

1.6.3 系列標準曲線溶液的制備 根據配制濃度，取定量的混合標準溶液，然后用0.1%甲酸水和甲醇（V/V，9:1）進行稀釋，配制成質量濃度為2.00 ～ 100.00 ng/mL （氯霉素， 氟苯尼考 0.50 ～40.00 ng/mL）標準曲線系列溶液。 由于有些藥物不穩定，混合標準溶液應實驗同時配制和使用，避光，密封并冷凍存放。

1.6.4 空白基質標準曲線系列溶液的制備 稱取均質的生乳樣品9 份 （精度為0.01 g）， 置于50 mL聚丙烯離心管中， 按照1.6.1 和1.6.2 中樣品前處理方法提取、凈化、離心，吸取有機相溶液，40 ℃旋轉蒸發至近干，加入2.0 mL 相應質量濃度的混合標準溶液，渦旋1 min，過微孔濾膜，得到質量濃 度 分 別 為 2.00、4.00、8.00、20.00、40.00、80.00、100.00 ng/mL（氯霉素、氟苯尼考 0.50、2.00、4.00、8.00、10.00、20.00、40.00 ng/mL） 的空白乳基質標準曲線系列溶液。 混合標準溶液應實驗同時配制和使用。

1.6.5 樣品測定 采用超高效液相色譜高分辨譜儀對空白基質標準曲線系列溶液和試液進行測定。 提取一級母離子的保留時間和精確質量數來實現初級定性， 再結合每種化合物的二級掃描離子信息，獲得更高的定性和定量結果數據。

2 結果與討論

2.1 優化色譜條件

2.1.1 流動相的選擇 對于提高分離度和改善目標化合物的峰形來說， 選擇合適的流動相是相對重要的。 根據待測化合物的分子結構及相關文獻報道（王立丹，2019），除酰胺醇外的其他化合物均適合在 ESI 源的陽離子模式下電離，因此在流動相純水相中加入一定比例的甲酸將有助于改善化合物電離效率，并且可使流動相處于酸性環境，改善化合物的峰形， 使pH 保持恒定。 實驗結果表明， 低濃度甲酸不會影響三種酰胺醇化合物的電離效率和峰形，最后水相選定含有0.1%甲酸的純水溶液。有機相選擇純甲醇（郭海霞等，2015）和純乙腈（朱萬燕等，2017）溶液。 通過比較得出，有機相為甲醇時，噪聲較低，32 種獸藥的色譜峰形、響應值、分離效果和靈敏度均優于乙腈，其中，磺胺甲氧噠嗪、 磺胺對甲氧嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶三種異構體也能很好地分離。當有機相為乙腈時，32種獸藥的色譜峰響應通常良好， 但是對三種磺胺同分異構體不能完全分開（圖1）。

圖1 兩種流動相對三種磺胺異構體的分離效果

2.1.2 選擇洗脫程序 由于獸藥數量多， 同類獸藥的性質也非常相似。如果采用等度洗脫方法，難以實現多組目標化合物的分離，因此，使用梯度洗脫程序。 該方法比較了四種不同梯度洗脫方案的色譜峰效應，四種梯度洗脫方案如表1 所示。在開始階段，水相在流動相中的比例較高，使色譜柱能很快達到平衡， 接近供試樣品的再溶解溶液的水相有機相比例，更適合待測化合物的出峰，可實現部分較高極性目標物的最優測定， 然后逐漸增加有機相比例，洗脫剩余部分較弱極性的目標物，當待測化合物全部檢測完畢后， 用初始流動相比例平衡色譜柱，以滿足連續進樣的需要。 比較程序1 和程序2，當始末流動相為0.1%甲酸水和甲醇溶液（95：5，V/V）時在梯度洗脫程序中，供試化合物的色譜峰響應值與（90:10，V/V）相比較高，峰形更對稱、 更銳利。 最后選擇0.1%甲酸水和甲醇溶液（95：5，V/V）作為梯度洗脫程序的始末流動相。 通過比較程序3 和程序4 發現， 將梯度洗脫時間延長到20.0 min 時，待測化合物色譜峰的峰形、響應值、出峰時間都能很好地滿足檢測要求，但是，它需要相對較長的時間， 并且不太適合大量樣本的分析。 當梯度洗脫時間減少到14.5 min，連續進樣幾次后， 發現樣品中待測化合物的出峰時間會發生變化，分離效果不滿意，呈現不穩定狀態，這是由于減少了分析平衡時間， 連續進樣后相互影響。 因此，綜合考慮色譜峰的出峰時間、響應值、峰形、靈敏度等因素，最終確定最佳方案為程序1。

表1 不同梯度洗脫程序

2.1.3 流速的選擇 流動相的流速對受試化合物的分離有影響，適當的流速可實現色譜峰很好的分離。 該方法選擇了 0.2、0.3 mL/min 和 0.4 mL/min 3 種流速，根據掃描圖譜分析，三種流速都可以有效分離待測化合物，但流速為0.4 mL/min，可調整測試化合物的出峰時間，提高整體檢測效率。最終流動相流速選擇為0.4 mL/min。

2.2 選擇質譜條件 Orbitrap 高分辨率質譜不需要優化每個化合物的質譜條件和碰撞能量， 這可以顯著縮短檢測方法的開發時間。

2.2.1 掃描方式 該方法比較了三種掃描模式Full MS、Target-SIM/dd-MS2 和 Full MS/dd-MS2。雖然可以在全掃描模式下定量檢測目標物， 但只有母離子精確質量數和保留時間， 比較容易導致假陽性結果；Target-SIM/dd-MS2 掃描方式是通過四極桿過濾目標母離子， 然后母離子以高能量進入碰撞池，獲得碎裂和生成的離子碎片信息，提高目標物的定性檢測精度， 可掃描模式對測試化合物的定量略有不足。當Full MS/dd-MS2 掃描模式用于測試化合物的定性篩選和定量時， 以母離子、特征碎片離子精確質量數和保留時間，能達到對待測化合物的定性篩查及準確定量的目的。 因此，選擇 Full MS/dd-MS2 作為掃描模式。32 種獸藥殘留的精確質量數和保留時間見表2 和圖2。

圖2 32 種獸藥的質譜圖

2.2.2 分辨率 對于復雜基質中痕量組分的定性和定量分析，分辨率起著重要作用。 分辨率決定了分子質量的準確性。分辨率越高越能區分分子量相近的物質。研究發現，當分辨率較高（R=140000）時，可使掃描速度降低，導致收集的點較少，出現不成峰形，無法進行準確定量的情況。 在連續采樣過程中，有可能結果不一致，關鍵質譜信息丟失，導致檢測結果重現性差，不穩定性增加。 當一級全掃描分辨率R=70000 時， 所有待測化合物都能與基質中的干擾物質基線分離，響應值顯著提高，基質中的干擾明顯降低?？紤]檢測方法的定性和定量精密度和準確度， 最終選用一級質譜全掃描分辨率為70000，二級質譜掃描分辨率為35000。

2.2.3 理論精確質量數 測試的32 種化合物中，3 種酰胺醇類藥物殘留以陰離子方式離子化，母離子為[M-H]-，其他29 種藥物殘留均以陽離子方式離子化，母離子為[M+H]+。 表2 列出了32 種獸藥殘留的理論精確質量數。通過對比參考物質的全掃描數據進行驗證，32 種供試化合物精確質量的相對質量偏差均小于5 mg/kg， 說明待測化合物的質量數準確度良好，滿足要求。

2.2.4 二級掃描條件 根據全掃描得到的待測化合物母離子精確質量數， 制作相對應的待測化合物列表進行二級質譜掃描。 待母離子強度達到閾值設置（1×106）， 能自動獲取二級質譜掃描信息。碰撞能量用梯度定義，分別為CE 20、40、60，也就是說有三種碰撞能量來分裂測試化合物， 最后加和得到豐富的二級碎片離子信息。此外，還可以調整動態排除及頂點觸發和 Top N 等參數以獲得有關碎片離子的高質量信息。 將動態排除時間6、8 s 和 10 s 進行比較。 結果表明， 測試的 32 種化合物的峰形在8 s 時較好。 當頂點觸發設定為2 ～ 6 s 且 Top N=10 時， 可以獲得滿意的二級碎片離子信息和圖譜。表2 列出了32 種測試化合物的保留時間、 精確質量理論值、 精確質量測量值（母離子）、相對質量偏差、二級碎片離子信息。

表2 32 種藥物的保留時間、精確質量數、相對質量偏差和二級碎片離子信息

2.3 樣品前處理條件的優化

2.3.1 提取溶劑的選擇 在多組分獸藥殘留分析中， 從樣品中提取出待測藥物殘留對于完成準確測定是非常重要的。 由于32 種受試化合物的化學性質存在顯著差異，因此在選擇提取劑時，應充分考慮受試化合物的極性和樣品基質的性質等化學性質。目前使用的提取溶液包括乙腈水溶液（國家質量監督檢驗檢疫總局，2007）、 乙腈和含有5%甲酸的乙腈（覃玲等，2018）等。

本研究中采用體積分數為1%氨水乙腈和1%乙酸乙腈兩種不同提取溶液提取待測化合物。實驗中發現，以1%乙酸乙腈對樣品只提取一次對磺胺類等堿性化合物的回收率影響較大（回收率在56%左右），主要是由于酸性相對強時，磺胺類等堿性化合物的電離度增加，導致在有機相中的溶解度降低。樣品先用1%氨水乙腈溶液進行第一次提取，然后再用1%乙酸乙腈溶液提取第二次， 兩次提取實驗結果顯示，回收率可大幅提高（69%以上）。 所

有的獸藥殘留物回收率在69% ～110%，平均回收率達到81.3%。 因此，根據提取情況，本研究最終選取1%氨水乙腈和1%乙酸乙腈溶液分別對樣品進行兩次提取的提取方式。

2.3.2 凈化方式的選擇 本研究選擇QuEChERS凈化方法進行實驗分析。 QuEChERS 凈化方法可有效去除奶基質中的干擾成分， 減弱基質效應。同樣的一份樣品，QuEChERS 凈化方法只需要13元左右。 QuEChERS 凈化方法具有高效、安全、經濟、實用等優點，越來越多地應用于動物源性產品的藥物殘留檢測工作， 這是當前凈化技術的發展趨勢（謝瑜杰等，2021；張鑫等，2021）。

QuEChERS 凈化方法中使用的常見吸附劑包括 C18、PSA、NH2和 GCB。 其中，NH2和 PSA 吸附劑的吸附機理相似。兩種吸附劑都具有弱陰離子交換能力，并且可以通過氫鍵與化合物相互作用。 可有效去除極性干擾物質，如色素、脂肪酸、有機酸、碳水化合物等。C18 吸附劑將十八烷基與硅膠基質結合，可去除一部分非極性雜質和脂肪等疏水性共提取物（高彥，2017）。 GCB 凈化劑對平面分子結構有很強的親和力，對苯環和弱極性化合物有很強的吸附作用，其可以凈化色素（葉綠素、類胡蘿卜素等）和一些甾醇類物質，凈化能力很強。

本研究從 C18、PSA 、GCB 三種凈化劑中搭配選擇兩種組合作為吸附劑，凈化效果見表3。 結果表明，當C18 與PSA 結合作為凈化劑時，可以獲得較好的凈化效果。 兩種組合對大部分目標化合物均能達到較好的回收率，但用GCB 凈化劑時對大環內酯類有明顯的吸附。 因此，最終選擇40 mg C18+100 mg PSA 作為凈化劑。

表3 兩組凈化劑在回收率范圍內的獸藥數量（添加水平：20 μg/kg）

2.3.3 再溶解液的選擇 樣品經提取、 凈化、濃縮、再溶解、過濾后，即可在儀器上進行測定。 在進樣測定分析過程中， 再溶解溶液最大程度地溶解測試化合物而不影響色譜峰的基線和峰形是非常重要的。 有文獻報道用0.1%甲酸水：乙腈（9:1，V/V）（付曉燕，2018） 和 1%甲酸水：1%甲酸乙腈（6:4，V/V）（郭海霞，2018）進行再溶解。 本研究比較了水和甲醇（9:1，V/V）、水和乙腈（9:1，V/V） ，0.1%甲酸水和甲醇（9:1，V/V）、0.1%甲酸水和乙腈（9:1，V/V）。水和甲醇（6:4，V/V）、水和乙腈（6:4，V/V），0.1% 甲酸水和甲醇 （6:4，V/V）、0.1% 甲酸水和乙腈（6:4，V/V）對待測化合物回收率的影響。根據各待測化合物的色譜峰基線、峰形和分離度、回收率計算等信息， 最終采用0.1%甲酸水和甲醇（9:1，V/V）的溶液作為再溶解液。

2.4 方法學驗證

2.4.1 標準曲線與檢出限評價 取質量濃度分別為 2.00、4.00、8.00、10.00、20.00、40.00、80.00、100.00 ng/mL （氯霉素、 氟苯尼考 0.50、2.00、4.00、8.00、10.00、20.00、40.00 ng/mL） 系列標準曲線溶液，利用標準品的響應峰面積和質量濃度制作標準曲線， 即可得到相應的線性回歸方程。 實驗結果表明， 所有組分在該質量濃度范圍內均具有良好的線性，相關系數（r）為 0.9962 ～ 0.9999。 以 3 倍信噪比計算的檢出限為1 ～10 μg/kg， 可滿足生乳藥物殘留檢測要求。

2.4.2 回收率和精密度評價 根據國家對所檢獸藥殘留判定依據（農業農村部，2019），制備三個質量分數為 5.0、20.0、50.0 μg/kg（氯霉素、氟苯尼考1.0、5.0、20.0 μg/kg）的陽性樣品，每個水平進行 3次平行實驗。 按照1.6.1 和1.6.2 步驟對樣品處理后上機測定并進行數據分析，結果見表4。 實驗結果表明， 三個水平樣品的回收率為60.1%～116.7%，RSD 為 1.2%～9.7%。 方法的準確性和重復性良好。 符合國家標準《GB/T 27417-2017 合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》（國家質量監督檢驗檢疫總局等，2017）， 可用于生乳中多種獸藥殘留的快速定性定量測定。

表4 空白乳樣中待測化合物的加標回收率和測定重復性（n=3）

3 結論

本研究采用QuEChERS 凈化，結合超高效液相色譜Q Exactive Orbitrap HRMS 高分辨質譜技術與一體的檢測方法，同時測定生乳中5 類32 種獸藥殘留分析， 結果表明各組待測化合物的分離度良好，色譜圖峰形尖銳，響應值高，基線噪聲低。不僅可以消除奶基質中雜質的干擾， 而且可以提高待測化合物的準確定性和定量結果， 同時具有樣品處理過程簡單、成本低、測量周期短、靈敏度高等特點。