植酸酶體外降解米糠粕中植酸的工藝研究

楊 華 ， 梁麗萍 ， 陳雪嬌 ， 張媛媛 ， 馬金鵬 ， 權志中 ， 楊 寧 ， 宣 麗

（1.沈陽市現代農業研發服務中心＜沈陽市農業科學院＞，遼寧沈陽 110025；2.遼寧康普利德生物科技有限公司，遼寧鐵嶺 112600；3.遼寧省飼料預消化專業技術創新中心，遼寧鐵嶺 112600）

為適應大宗飼料原料供需趨緊的形勢， 提升原料利用效率，立足國情構建新型日糧配方結構，加快推進玉米、豆粕減量替代，開發非常規性飼料資源已成為當前研究的熱點。 米糠粕是大米加工的副產品，資源豐富，價格低廉，含有較高的營養成分，可以作為玉米豆粕減量替代的原料之一（曹康寧，2019）。但是由于米糠粕中非淀粉多糖（賈素巧等，2019）和植酸（張抒愛等，2021）等抗營養因子含量較高， 用量過高往往會影響飼糧整體養分消化， 導致畜禽生產性能下降 （韓萍萍等，2020；Sanchez 等，2019；孫偉武等，2017；葉永青和羅小溪，2017；錢利純和尹兆正，2005），在應用時比例受到限制。

植酸是米糠粕中重要的抗營養因子， 比例高達 8%（馬澤林，2017；Casas 和 Stein，2016）。 由于植酸化學性質比較穩定， 難以通過加熱等物理處理方法破壞， 在動物體內也沒有相應的酶系能消化降解。目前主要是通過在飼料中添加植酸酶，在動物體內對植酸進行降解， 而且得到了極廣泛的應用 （Ranjan 等，2021；Neto 等 ，2021；Maas 等 ，2020； 紀婷婷等，2017； 周定勇，2015；Kumar 等，2012）。 然而，酶制劑在體內的作用效果只能通過飼養試驗生產性能的表現來反向評估。 Rosenfelder-Kuon 等（2020a）研究表明，隨著植酸酶的添加，雖然在豬的糞便中，植酸的回收率很低，但豬的平均磷消化率穩定在65%，并且在高水平添加植酸酶的情況下， 豬全腸道磷消化率也不超過60%。因此，有必要尋求獲得更高磷消化率的處理技術（Rosenfelder-Kuon 等，2020b）。

飼料預消化技術是為了提高飼料原料的消化吸收率，在動物體外，根據不同原料的具體特性，模擬動物的消化過程， 進行的特定化處理的生物飼料加工技術。 酶解預消化是將原料、酶制劑、水混合，在一定的作用條件下，對目的物進行處理的一種飼料預消化手段，過程可控制，結果更明確，在原料預處理方面受到普遍關注。 本試驗采用酶解的手段，用植酸酶體外酶解米糠粕，通過單因素和正交試驗觀察植酸的降解程度， 以期為后續的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑 供試材料：米糠粕由遼寧康普利德生物科技有限公司提供， 含粗蛋白質16.9%、 粗脂肪 1.38%、 粗灰分 11.9%、 總磷1.55%、粗纖維8.0%、中性洗滌纖維33.3%、酸性洗滌纖維10.4%、酸性洗滌木質素3.3%。 植酸酶1、植酸酶 2、植酸酶 3（活力均為 1.0×104U/g）來自遼寧省飼料預消化專業技術創新中心實驗室。

供試試劑：濃鹽酸、硫酸鈉、磺基水楊酸、三氯化鐵、氫氧化鈉，分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；植酸鈉標準品，純度98%（北京譜析科技有限公司）。

1.2 主要儀器 UV-1700 型紫外可見分光光度計（日本島津公司）；HJ-M6 型水循環磁力攪拌水浴鍋 （金壇市城西春蘭實驗儀器廠）；STARTER 3100 型 pH 計、CP 214 型電子天平 （上海奧豪斯儀器有限公司）；SHA-B 型水浴恒溫振蕩器（金壇市精達儀器制造廠）；FW177 型中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；SC-3614 型低速離心機 （安徽中科中佳科學儀器有限公司）；101FA-0型電熱鼓風干燥箱 （上海樹立儀器儀表有限公司）。

1.3 植酸的測定 稱取1 g 米糠粕、酶解米糠粕樣品，精確至0.0001 g，置于100 mL 具塞三角瓶中， 加入 40 mL 的 1.2% HCl·10% Na2SO4溶液，于室溫下振蕩 2 h，4000 r/min 離心 20 min， 上清液于4 ℃冰箱中備用待測（傅啟高等，1997）。

標準曲線的制作： 精確吸取0.1 mg/mL 植酸標準溶液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于 6 支 25 mL具塞試管中，用蒸餾水補足至5 mL，混勻后，加入4 mL 的 0.3%磺基水楊酸·0.03% FeCl36H2O 溶液，搖勻，放置15 min 后，于500 nm 處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，植酸含量為橫坐標，繪制標準曲線并計算回歸方程及相關系數。

取稀釋到一定濃度的植酸提取液5 mL 于25 mL 具塞試管中，其余步驟同標準曲線的制作，測其吸光度， 并從回歸方程計算出試液中植酸含量。

式中：m1為酶解前米糠粕中植酸的百分含量；m0為酶解后米糠粕中植酸的百分含量。

1.4 試驗設計 能夠準確測定米糠粕酶解pH的最低加水量為：料水比 1：3（g/mL），本試驗固定酶解反應的料水比為1：3， 首先研究不同pH條件下3個植酸酶的酶解效果，在此基礎上探究不同酶解溫度、酶添加量、酶解時間對米糠粕中植酸的降解效果。 在單因素試驗基礎上，采用正交試驗優化酶解條件，從而確定植酸酶體外酶解的工藝條件。

1.5 單因素試驗

1.5.1 植酸酶在不同pH 條件對米糠粕中植酸降解率的影響 稱取30.00 g 米糠粕若干份于250 mL燒杯中，加蒸餾水90 mL，用1 mol/L 的HCl 調pH為 3.9、4.3、4.7、5.1、5.5， 植酸酶 1、2、3添加量均為1.2%（酶質量/米糠粕質量），50 ℃酶解 2.0 h。 反應結束后，沸水浴滅酶，樣品85 ℃烘干，粉碎后提取植酸，測定植酸含量并計算植酸降解率。

1.5.2 酶解溫度對米糠粕中植酸降解率的影響料水比1：3，酶解 pH 4.7，植酸酶3 添加量 1.2%，酶解時間 2.0 h，酶解溫度 40、45、50、55、60 ℃，其余操作同1.5.1。

1.5.3 酶添加量對米糠粕中植酸降解率的影響料水比 1：3，酶解 pH 4.7，酶解溫度 50 ℃，酶解時間 2.0 h， 植酸酶 3 添加量 0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%、2.1%、2.4%，其余操作同 1.5.1。

1.5.4 酶解時間對米糠粕中植酸降解率的影響料水比 1：3，酶解 pH 4.7，酶解溫度 50 ℃，植酸酶3 添加量 1.8%， 酶解時間 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h，其余操作同 1.5.1。

1.6 正交試驗 在單因素試驗的基礎上，以植酸降解率為指標，對植酸酶3 酶解pH、酶解溫度、酶添加量以及酶解時間設計四因素三水平L9（34）正交優化試驗， 以確定植酸酶3 體外酶解米糠粕的工藝條件。

1.7 植酸降解驗證試驗 對正交試驗獲得的最佳酶解條件進行驗證試驗， 并參照食品安全國家標準-食品中肌醇的測定GB 5009.270-2016 檢測肌醇含量。

1.8 數據統計分析 試驗數據經Excel 2010 進行整理后， 采用SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析方法（one-way ANOVA），并利用 Duncan’s 法進行多重比較，P ＜0.05 為差異顯著。

2 結果與討論

2.1 植酸標準曲線繪制 以吸光度為縱坐標，植酸含量為橫坐標，繪制標準曲線見圖1。

圖1 植酸標準曲線

2.2 單因素試驗

2.2.1 植酸酶在不同pH 條件對米糠粕中植酸降解率的影響 本試驗首先研究了不同pH 條件下3 種植酸酶的酶解效果，結果如圖2 所示。 植酸酶1、植酸酶2、植酸酶3 對米糠粕中植酸的降解率均是隨著pH 的增加呈現先升高后降低的趨勢，在pH 為4.7 時， 米糠粕中植酸的降解率最高，分別為86.9%、89.4%、92.8%。 pH 3.9 時的植酸降解率均高于pH 5.5，表明只有當酶解體系酸性降低到一定程度時， 植酸酶對米糠粕中植酸的降解效果才更優。植酸酶3 不僅酶解效果最好，且對酸性環境的耐受力也最強， 因此選擇該酶進行后續試驗。

圖2 不同pH 條件下3 種植酸酶對米糠粕中植酸降解率的影響

2.2.2 酶解溫度對米糠粕中植酸降解率的影響由圖3 可知，隨著酶解溫度的升高，植酸降解率呈現先升高后降低的趨勢，在50 ℃時，植酸降解率最高， 低于50 ℃時的酶解效果優于高于50 ℃的酶解效果，結合多重比較分析結果，選取40、45、50 ℃三個水平進行正交試驗。

圖3 酶解溫度對米糠粕中植酸降解率的影響

2.2.3 酶添加量對米糠粕中植酸降解率的影響由圖4 可知， 當植酸酶3 添加量從0.3%增加到1.2%時，植酸降解率差異顯著，隨著酶量繼續增加到1.8%，植酸降解率沒有繼續升高，當酶量增加到2.1%時， 植酸降解率開始出現下降趨勢，為了進一步考察最適酶添加量， 選取1.2%、1.5%、1.8%三個水平進行正交試驗。

圖4 酶添加量對米糠粕中植酸降解率的影響

2.2.4 酶解時間對米糠粕中植酸降解率的影響由圖5 可知， 當酶解時間從0.5 h 增加到1.5 h時，植酸降解率差異顯著，隨著酶解時間繼續延長，植酸降解率開始有下降趨勢，當酶解時間增加到3.5 h 時，植酸降解率達到最大值，之后又出現下降趨勢， 為了進一步考察最適酶解時間， 選取1.5、2.0、3.5 h 三個水平進行正交試驗。

圖5 酶解時間對米糠粕中植酸降解率的影響

2.3 正交試驗結果分析 在單因素試驗的基礎上，進行正交試驗，試驗設計和結果見表1，方差分析結果見表2。 由表1、表2 數據可知，酶解pH（P ＜ 0.001）、酶解溫度（P ＜ 0.001）、酶解時間（P ＜0.001）均是影響植酸降解率的極顯著因素，酶添加量（P ＜0.05）是影響植酸降解率的顯著因素。植酸酶3 體外降解米糠粕中植酸的最適條件是A2B3C3D3，即酶解 pH 4.7、酶解溫度 50 ℃、植酸酶添加量1.8%、酶解時間3.5 h。

表1 正交試驗設計與結果

表2 正交試驗方差分析

2.4 酶解驗證試驗結果 將米糠粕與水按照1：3（g/mL） 的比例混合， 用 1 mol/L 的 HCl 調 pH 為4.7， 加入1.8%（酶的質量/米糠粕質量） 的植酸酶3，50 ℃酶解 3.5 h，反應結束后，沸水浴滅酶，樣品85 ℃烘干，測定植酸降解率為94.2%，肌醇含量為1.9%。 表明米糠粕中85%以上的植酸均轉化為肌醇，本研究確定的酶解工藝在顯著降解米糠粕中植酸抗營養因子的同時，提高了米糠粕的營養價值。

3 結論

本研究通過單因素和正交試驗， 確定了米糠粕中植酸體外降解的最優酶解條件為： 植酸酶3添加量1.8%、酶解pH 4.7、酶解溫度50 ℃、酶解時間3.5 h。 該條件下， 米糠粕中植酸降解率為94.2%，肌醇生成量為1.9%。