基于基因分析的產胞外多糖乳酸菌的篩選及其體外抗氧化研究

呂青遙，雷霜江，包善思，陳文文，陳怡均，焦士蓉

（西華大學 食品與生物工程學院，成都 610039）

0 引言

乳酸菌(LAB，lactic acid bacteria)是一類通過發酵糖類物質產生乳酸的無芽孢革蘭氏陽性菌的總稱，至少含有23個菌屬，共200余種[1]。乳酸菌作為一種重要的益生菌，可以凈化腸內環境，調節人體胃腸道健康及微生態環境平衡[2]。乳桿菌屬、雙歧桿菌屬的某些菌株被證實具有提高免疫力、降血壓、抗氧化、改善腸道菌群等生理功能[3-4]。乳酸菌胞外多糖（Exopolysaccharide，EPS）是指乳酸菌在培養基中發酵產生的一類結構復雜的糖類化合物[5]。LAB EPS一般包括釋放到培養基中的黏液多糖（slime polysaccharide，SPS）和附著在細胞壁的莢膜多糖（capsular polysaccharides，CPS）[6]。LAB產生的EPS按組成可分為由同一種單糖組成的同多糖 和由兩種或兩種以上單糖組成的雜多糖[7]。在生理功能上，胞外多糖具有良好的抗腫瘤[8-9]、增強免疫抵抗力[10-11]和抗氧化[12]等活性。在物化特性上，EPS能改善發酵乳制品的質地、組織狀態、風味和感官[13]，對豆制品的流變性、乳化性、黏著性都有顯著影響，極大地提高了其質構、凝膠和流變性能[14]。

本研究以實驗室保藏的15株乳酸菌為篩選源，測定他們的產胞外多糖能力，并對其所產胞外多糖的體外抗氧化活性進行研究，綜合兩方面選出優勢菌進行全基因組序列分析，為進一步高通量篩選高產EPS菌株和構建基因工程菌提供前期的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用菌株是從以四川傳統泡菜、魚腸道、微生物藥劑為篩選源，選出降膽固醇能力＞30%且具有耐酸耐膽鹽能力的15株乳酸菌。

核酸染料，生工生物工程（上海）股份有限公司；細菌DNA提取試劑盒，成都福際生物技術有限公司；瓊脂糖，生工生物工程（上海）股份有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 實驗儀器

SPX-150B-Z生化培養箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；WFJ7200分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司；Easycycle Gradient 96梯度PCR儀、BDA Box 2凝膠成像系統，Analytikjena；DYY-8C雙定時電泳儀，北京市六一儀器廠。

1.3 培養基

MRS培養基（1 000 mL）：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，檸檬酸氫二銨2 g，葡萄糖20 g，吐溫（-80）1 mL，乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，瓊脂15~20 g，滅菌后使用。

1.4 實驗方法

1.4.1 乳酸菌胞外多糖的提取

參考李儀琳等的實驗方法并做適量改動[15]。將供試乳酸菌活化后接種到胞外多糖MRS液體篩選培養基中，37℃靜置培養48 h，取10 mL培養液于試管中，加入1/3體積的Sevag試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1），震蕩30 min后，4 000 r/min離心15 min，收集上層水相溶液，重復以上操作至兩相之間無蛋白質層為止。隨后加入3倍體積的冰凍無水乙醇，放置在4℃冰箱中冷藏。第2天取出，最終可以觀測到多糖呈乳白色絮狀沉淀析出，再于4℃、6 000 g下離心30 min，用10 mL蒸餾水溶解沉淀，可得胞外多糖提取液，胞外多糖粗提液冷凍干燥的胞外粗多糖。

1.4.2 胞外多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法進行測定，參照陶靜的做法[16]。EPS質量濃度由標準曲線的回歸方程和稀釋倍數換算出。

1.4.3 EPS對DPPH自由基的清除作用

參考丁武榮等的實驗方法并做適量改動，用去離子水和DPPH溶液作為對照[17]。用樣品和無水乙醇作為空白。測定517 nm處的吸光度，每組至少3個重復。以Trolox為標準品繪制標準曲線，得到標準曲線回歸方程為Y=0.5673X+9.0774，R2=0.9946。根據標準曲線計算出樣品提取液的EPS含量，以每g提取物中Trolox當量計（mg/g）。

DPPH清除率(%)=[1-(A樣品-A空白)/A對照]×100

式中：A樣品為樣品溶液與DPPH反應的吸光度；A空白為無水乙醇代替DPPH的吸光度；A對照為無水乙醇代替樣品溶液及蒸餾水的吸光度。

1.4.4 EPS對ABTS自由基的清除作用

參考劉城移等的實驗方法[18]。以Trolox為標準品繪制標準曲線，得到標準曲線回歸方程為Y=0.6058X-0.8838，R2=0.9966。根據標準曲線計算出樣品提取液的EPS含量，以每g提取物中Trolox當量計（mg/g）。

ABTS自由基清除率(%)=[1-(A樣品-A對照)/A空白]×100

式中，A樣品為不同濃度的樣品與ABTS+工作液反應的吸光度；A對照為去離子水代替ABTS+工作液反應的吸光度；A空白為去離子水代替樣品組的吸光度。

1.4.5 EPS的ORAC實驗

參考Mu G等的實驗方法并做適量改動[19]，向96孔板各孔加入20μL不同濃度Trolox標準品溶液（或樣品），以緩沖液代替樣品或標品為陽性對照（+APPH），以及隨后每孔加入4.0 nmol/L 20μL FL熒光試劑，37℃孵育20 min。測定時加入140μL 12.8 mmol/LAAPH溶液啟動反應，用緩沖液替代APPH為陰性對照（-APPH）將96孔板置于預熱至37℃酶標儀中5 min。

以激發波長(485±20)nm,發射波長(530±20)nm進行連續測定熒光強度,測定時間設定在熒光衰減呈基線后為止，約60次循環(2 h)。

試驗所得的各微孔不同時間點的絕對熒光強度數據與其初始時間的熒光強度相比,折算成相對熒光強度f，以相對熒光強度采用近似積分法計算熒光衰退曲線下面積(AUC)。

AUC=0.5×[2×(f0+f1+…+fn-1+fn)-f0-fn]×△t,其中fn標示第n個測定點的相對熒光強度,△t標示相鄰兩個時間點之間的時間間隔(即2 min),則上述公式可簡化為:AUC=2×(f0+f1+…+fn-1+fn)-f0-fn。

ORAC值=[(AUC樣品-AUC空白)/(AUCTrolox-AUC空白)]×(Trolox濃度(μmol/L)/樣品濃度(g/L))

式中：AUC樣品為樣品作用下的各微孔熒光衰退曲線下面積；AUCTrolox為水溶性維生素E作用下的熒光衰退曲線下面積；AUC空白為僅有AAPH作用下的熒光衰退曲線下面積；Trolox濃度為標準品水溶性維生素E的濃度，μmol/L。

每組實驗至少3個重復，以Trolox為標準品繪制標準曲線，得到標準曲線回歸方程為Y=0.6741X+13.284，R2=0.9971。根據標準曲線計算出樣品提取液的EPS含量，以每g提取物中Trolox當量計（mg/g）。

1.4.6 EPS的FRAP實驗

參考梅邢等的實驗方法并做適量改動[20]，將300 mmol/L，pH=3.6的醋酸緩沖液、10 mmol/L TPTZ溶液、20 mmol/L三氯化鐵溶液以10∶1∶1配置成FRAP工作液，在96孔板中加入50μL 1g/L的胞外粗多糖水溶液和150μL FRAP工作液為樣品組，以蒸餾水代替樣品為對照組，室溫下放置20 min，在593 nm處測吸光度，每組至少3個重復。以Trolox為標準品繪制標準曲線，得到標準曲線回歸方程為Y=0.0054X+0.127，R2=0.9984。根據標準曲線計算出樣品提取液的EPS含量，以每g提取物中Trolox當量計（mg/g）。

1.4.7 生理生化試驗

對乳酸菌進行過氧化氫酶試驗、葡萄糖發酵試驗、淀粉水解試驗、葡萄糖產氣試驗、pH=4.0、pH=9.0、15℃、45℃生長試驗、耐鹽性試驗、甲基紅試驗、v-p乙酰甲基甲醇試驗、酪素水解試驗。參考蒲博等的實驗方法并做適量改動[21]。

1.4.8 16S rRNA基因鑒定及系統發育樹的構建

參考Zhang等人方法[22]，綜合胞外多糖產率及其抗氧化活性，選出產EPS能力較高，EPS抗氧化活性強的11株乳酸菌進行鑒定。鑒定過程主要包括細菌基因組DNA的提取，PCR的擴增，PCR產物的回收，序列的測定與回收。得到序列結果后在NCBI數據庫中進行比對，并用MEGA5軟件構建系統發育樹。

1.4.9 R5全基因組測序分析

將活化后的R5菌體送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行全基因組測序。

1.5 數據分析

采用Excel 2010分析處理數據，所有數據均重復3次試驗所得，并計算平均值和標準誤差，并繪制圖表；采用SPSS 18.0軟件對數據進行差異顯著性分析。

2 實驗結果

2.1 乳酸菌EPS產量

乳酸菌產胞外多糖的結果，如表1所示。

表1 乳酸菌胞外粗多糖產量(±s,n=3)

表1 乳酸菌胞外粗多糖產量(±s,n=3)

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15株乳酸菌均有一定的產胞外多糖能力，胞外多糖產量在374.19~710.73 mg/L之間，產量低于400 mg/L的有1株，400~500 mg/L的有3株，500~600 mg/L的有6株，大于600 mg/L的有5株，分別為R4、R5、R27、R28、R40，其中R38產量最低為374.19±9.30 mg/L，R40產量產量最高達710.73±23.25 mg/L。

2.2 乳酸菌EPS抗氧化實驗結果

乳酸菌EPS的抗氧化結果如表2所示，實驗結果表明，不同菌株胞外多糖對DPPH自由基清除能力差異顯著（P＜0.05），其中R4清除DPPH自由基的清除能力最強，達到19.89±0.54 mg/g Trolox當量。不同菌株胞外多糖對ABTS自由基清除能力差異顯著（P＜0.05），其中R47清除ABTS自由基的清除能力最強，達到190.77±9.53 mg/g Trolox當量。不同菌株胞外多糖ORAC氧化自由基吸收能力差異顯著（P＜0.05），其中R39氧化自由基吸收能力最強，達到101.40±4.20 mg/g Trolox當量。不同菌株胞外多糖FRAP鐵還原能力差異顯著（P＜0.05），其中R5鐵還原能力最強，達到7.65±0.64 mg/g Trolox當量。從4種不同抗氧化實驗中可以看出，同一種菌株胞外多糖在不同的抗氧化實驗中，差異顯著（P＜0.05），乳酸菌胞外多糖的抗氧化在幾組實驗中ABTS體系＞ORAC體系＞DPPH體系＞FRAP體系，表明乳酸菌胞外多糖對于ABTS自由基的清除率最高，而鐵原子還原能力較低。

表2 乳酸菌抗氧化活性實驗結果(x-±s,n=3)

（續表2）

2.3 生理生化實驗結果

綜合生理生化試驗結果，根據《常見細菌系統鑒定手冊》及《伯杰氏細菌鑒定手冊》，我們可對15株乳酸菌的大致分類做如下判斷，其中C28、C60、J3、R5、R8、R10、R24、R27、R28、R38、R39、R43、R47屬于乳桿菌屬，R4、R40屬于腸球菌屬。

表3 生理生化實驗結果

2.4 16S rRNA序列法分析鑒定

綜合胞外多糖產率及其抗氧化活性，選出產EPS能力較高，EPS抗氧化活性強的11株乳酸菌進行16S rRNA序列法分析測定，凝膠成像結果如圖1所示。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳圖

由圖1可知，11株菌的16S rRNA PCR產物長度為1.5Kbp，將測序結果進行BLAST在線分析，結果表明，9株菌為鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosu 2717），R4、R40兩株菌為屎腸球菌（Enterococcus faecium 6583），基因測序結果與生理生化試驗結果吻合，11株菌的系統發育樹如圖2所示。

圖2 系統發育樹圖

2.5 鼠李糖乳桿菌R5基因組中產EPS基因簇分析

全面綜合比較后，因R5產多糖量和抗氧化活性均較高，所以選R5進行后續深入研究。通過將鼠李糖乳桿菌R5基因序列與NCBI上與產EPS有關的相關基因序列進行比對，發現R5基因序列中與EPS產生有關的基因都在Scaffold2上，比對結果如表4所示。從表4中看出，Identity＞98%，表明R5基因序列與相關基因序列一致性高。R5與相關基因Evalue值為0，可信。因此可以說明鼠李糖乳桿菌R5基因中有19個與EPS產生相關的基因，產EPS相關基因在R5基因序列中的查詢情況見表5。在這些產EPS相關基因中，gene0524、0531、0533、0534、0536是編碼糖基轉移酶的基因，糖基轉移酶基因的存在與EPS重復單元結構之間存在高度相關，可用于今后篩選新的鼠李糖菌株[22-23]通過對比發現，R5所產的多糖為莢膜類多糖。

表4 R5基因序列比對結果

表5 產EPS相關基因在R5基因組中的查詢結果

（續表5）

圖3 R5基因序列中產EPS相關基因組圖譜

3 結論

15株乳酸菌均有一定的產胞外多糖能力，胞外多糖產量在374.19~710.73 mg/L之間。綜合產EPS能力和所產EPS的抗氧化能力結果，R5 EPS產量較高678.01±17.44 mg/L，且R5的EPS在幾種抗氧化體系中能力都較強，其中在DPPH體系中為18.58±0.65 mg/g Trolox當量，在ABTS體系中為163.78±7.64 mg/g Trolox當量，在ORAC體系中為68.38±7.19 mg/g Trolox當量，在FRAP體系中為7.65±0.64 mg/g Trolox當量。因此選擇R5進行后序實驗。

對鼠李糖乳桿菌R5進行全基因組測序，得到原始數據的總堿基數為1164790444（bp），對原始數據進行過濾，得到質控后的總堿基數為1143095840（bp）。通過將鼠李糖乳桿菌R5基因序列與NCBI上與產EPS有關的相關基因序列進行比對得知，其所產多糖為莢膜類多糖。在鼠李糖乳桿菌R5基因序列中，找到了19個產EPS相關基因。為進一步高通量篩選高產EPS菌株和構建基因工程菌提供前期的實驗基礎。