益生菌產品中雙歧桿菌計數培養基的比較研究

陳清艷

（上海旺旺食品集團有限公司，上海 201103）

0 引言

雙歧桿菌是人體和部分動物腸道內重要的組成部分，具有調整腸道功能及改善營養的作用、抗過敏、抗腫瘤和控制葡萄糖代謝等益生功能[1-9]。目前食品中可添加的雙歧桿菌種類、菌株及產品形式呈多樣化，雙歧桿菌對營養需求及培養條件較為苛刻，其生長特性存在差異[10-12]，因此針對不同產品中雙歧桿菌計數時，國標方法計數結果跟理論值存在較大差異。雙歧桿菌活菌數量是評價產品功能性的關鍵指標，生產者有必要深入研究其培養條件，盡可能準確地證實其產品中雙歧桿菌活菌的實際水平。本實驗以乳雙歧桿菌BB12和長雙歧桿菌BB536益生菌錠片為樣品，比較了MRS、半胱氨酸鹽酸鹽+MRS、雙歧桿菌計數瓊脂BBL 3種培養基培養計數結果，以選擇最適合的培養基對益生菌產品中雙歧桿菌進行計數實驗。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MRS(ManRogosaS harpe)培養基、雙歧桿菌計數瓊脂BBL培養基、半胱氨酸鹽酸鹽、磷酸鹽緩沖液、西紅柿浸出液，北京陸橋；乳雙歧桿菌BB12錠片、長雙歧桿菌BB536錠片，本實驗室自制。

1.2 儀器與設備

電磁加熱攪拌器SLR，德國SCHOTT；高溫高壓滅菌釜MLS-3751L-PC，日本松下；拍擊式均質器bagmixer 400vw、BagPipet移液器，法國Interscience；旋渦振蕩器，德國IKA；雙人垂直超凈工作臺CDA-1650-1，上海上凈；AW 200SG厭氧工作站，英國ELECTROTEK；50i生物顯微鏡，NIKON。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品稀釋

無菌操作稱取樣品25 g，加入225 mL的無菌磷酸鹽緩沖液中，拍擊式均質2 min，充分振搖混合均勻，制成10-1稀釋度的樣液；吸取10-1稀釋度樣液1 mL，加入9 mL無菌磷酸鹽緩沖液中，旋渦振蕩制成10-2稀釋度；依次操作，制成目標稀釋度。

1.3.2 接種

根據樣品益生菌添加量預估其可能雙歧桿菌含量，選擇3個合適稀釋度的樣液接種，每種培養基每個稀釋度分別接種2個平皿，每皿加樣1 mL，故每個稀釋度樣液分別接6個平皿，其中2個平皿傾注MRS培養基；2個平皿傾注半胱氨酸鹽酸鹽+MRS培養基，2個平皿傾注BBL培養基。

1.3.3 培養

待瓊脂凝固后，將平板倒置于厭氧工作站，36±1℃培養72±2 h。

1.3.4 菌落觀察計數

選取菌落數在30~300 CFU內的平板計數。

1.3.5 涂片鏡檢

觀察細胞形態和純度（是否有雜菌），雙歧桿菌為革蘭氏陽性，無芽胞，桿狀；乳雙歧桿菌BB12呈短桿狀，有時候一端呈匙狀，單個或成對；長雙歧桿菌BB536呈細長桿狀，有時候一端或兩端分叉。

1.3.6 菌落數計算

依GB 4789.35 6.4計算每g樣品中雙歧桿菌菌落數[13]。

2 結果與討論

2.1 計數結果比較分析

添加乳雙歧桿菌BB12的益生菌錠片樣品，MRS、半胱氨酸鹽酸鹽+MRS（以下簡寫為CYSMRS）、BBL 3種培養基計數結果如下表1，BBL計數結果較MRS、CYS-MRS高，CYS-MRS培養基計數結果普遍高于MRS；BBL平板的上的菌落較小，需要借助菌落計數器觀察計數，MRS、CYSMRS平板上的菌落較大，肉眼即可觀察計數，如圖1所示。

圖1 乳雙歧桿菌BB12培養情況

表1 3種培養基對BB12錠片樣品中雙歧桿菌計數結果

對表1計數結果進行分析，MRS與CYS-MRS培養計數結果無顯著差異（P＞0.05），MRS與BBL、CYS-MRS與BBL培養計數結果差異顯著（P＜0.05）。

對添加長雙歧桿菌BB536的益生菌錠片樣品，MRS、CYS-MRS、BBL 3種培養基計數結果如表2。3種培養基計數結果差異不明顯，菌落生長情況同BB12，BBL平板上菌落較小，MRS、CYS-MRS平板上菌落較大。

表2 3種培養基對BB536錠片樣品中雙歧桿菌計數結果

（續表2）

對表2計數結果進行數據分析，MRS、CYSMRS和BBL 3種培養基培養計數結果無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 細胞形態觀察結果

革蘭氏染色后，在物鏡100×油鏡，15×目鏡條件下鏡檢。乳雙歧桿菌BB12細胞呈革蘭氏陽性，棒狀，有時候一端呈匙狀，單個或成對排列如圖2。長雙歧桿菌BB536的細胞呈細長桿狀，一端有時呈匙狀，有時一端或兩端呈分叉狀，單個排列，如圖3。形態隨培養時間和培養基可能有變化。

圖2 乳雙歧桿菌BB12的細胞形態

圖3 長雙歧桿菌BB536的細胞形態

3 結論

根據56個添加雙歧桿菌的益生菌錠片樣品中雙歧桿菌測定結果看，添加乳雙歧桿菌桿菌BB12的錠片樣品，MRS、半胱胺酸鹽酸鹽+MRS、BBL 3種培養基計數結果差異較顯著，BBL計數結果最高，其次是半胱氨酸鹽酸鹽+MRS，MRS培養基計數結果最低；對于添加長雙歧桿菌BB536的益生菌錠片樣品，上述3種培養基計數結果差異不顯著。BB536錠片樣品種雙歧桿菌計數結果與預估添加菌量相近；BB12墊片樣品中雙歧桿菌計數結果較預估添加菌量低了約3個log/g，可能錠片加工工藝對該菌株活性損傷較大所致。

為了準確對雙歧桿菌檢驗計數，很多實驗室針對不同產品基質、不同稀釋液、培養方式、鑒定方法等已經進行大量研究。現行標準方法有：（1）GB 4789.35[13]適用范圍為食品樣品，雙歧桿菌計數培養基為添加莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽的改良MRS，莫匹羅星鋰鹽能夠抑制乳桿菌的生長而不抑制雙歧桿菌的生長，L-半胱氨酸能夠提供雙歧桿菌生長的還原性環境，促進雙歧桿菌生長[14]；（2）GB 4789.34[15]適用范圍是產品中僅含有雙歧桿菌屬的樣品，培養基為雙歧桿菌計數瓊脂BBL或MRS瓊脂培養基；（3）QB/T 4575[16]食品加工用乳酸菌中A.4對于單純的雙歧桿菌的檢測，采用MRS或TOS培養基。在200 mL培養基中加入2 mL濃度為5%的鹽酸半胱氨酸溶液（每次使用前配制）。

根據以上標準方法，對僅含有雙歧桿菌屬的樣品進行雙歧桿菌培養計數時，可以選擇半胱氨酸鹽酸鹽+MRS、雙歧桿菌計數培養基BBL、MRS培養基或TOS培養基。

另外，樣品溶解用稀釋液的選擇，對雙歧桿菌的計數結果可能也有影響。王似錦等[14]比較了生理鹽水（NS）、林格液（QSR液）、磷酸鹽緩沖液（PBS緩沖液）、半胱氨酸磷酸鹽緩沖液(CYS緩沖液)4種稀釋液進行雙歧桿菌計數的結果差異，發現CYS緩沖液作為稀釋液時計數結果最高，討論可能因CYS緩沖液中的L-半胱氨酸鹽酸鹽具有還原性，可以為雙歧桿菌生長提供一定的厭氧環境，并且CYS緩沖液含有吐溫80能使雙歧桿菌更充分的釋放和分散均勻。因此，有必要進行稀釋液比對實驗，根據產品特性及產品中添加的雙歧桿菌的菌種及菌株不同，以針對性地選擇最佳稀釋液，從而有利于提高雙歧桿菌的檢出率，準確計數。后續將進一步進行稀釋液比對實驗，及稀釋液與培養基組合比對實驗，以確認該兩種雙歧桿菌產品的最優稀釋液和培養基。

依實驗數據看，相同工藝生產的雙歧桿菌益生菌產品，若所含的雙歧桿菌的菌種不同，不同培養基進行培養計數，結果可能存在差異。要對產品中雙歧桿菌準確計數定量，則有必要對雙歧桿菌計數的多種培養基進行比對實驗，選擇最優培養基用于雙歧桿菌的培養計數，使結果更精準，為益生菌產品開發階段評價原料及產品中雙歧桿菌的含量及益生菌產品在儲存期間雙歧桿菌的穩定性、工藝及配方的改進提供可靠的參考數據。