基于近紅外光譜反射技術的碭山酥梨花粉活力快速檢測

徐葉挺，張校立，莊紅梅，董文軒，龔 鵬

(1.新疆農業科學院園藝作物研究所/農業部新疆地區果樹科學觀測實驗站，烏魯木齊 830091；2.沈陽農業大學園藝學院，沈陽 110866)

0 引 言

【研究意義】花粉是有花植物雄蕊中的雄性生殖細胞，高等植物的雄配子體[1]。花粉是高等植物的雄配子體，在育種上可用來解決不同果樹品種開花期不遇和異地果樹品種雜交困難問題。人工輔助授粉或雜交授粉，需要早期采集和貯存花粉，尤其是雜交育種[4]，花粉生活力是花粉具有存活、生長、萌發或發育的能力[5]。【前人研究進展】檢測花粉活力的方法有染色法、萌發法、授粉結實檢測法及其他一些方法，常用的染色法有聯苯胺染色法[6]、TTC染色法[7]、I2-KI染色法[8]、FCR染色法[9]等，萌發法又包括離體萌發法[10]和活體萌發法[11]。目前這些花粉活力的測定方法中，染色法測定值不是偏高就是偏低[6]。離體萌發法測定值準確可靠，但步驟多影響因素多難掌握[11]。活體萌發測定法，僅適合于感受性柱頭，測定值偏低，柱頭表面性質對所測試樣也有所限制[11]。花粉授粉結實檢測法，時間周期長，費時費力，且花粉粒較小，人工授粉時不能定量只能定性[12]。近紅外檢測技術是一種具有方便、快速、高效、準確、不破壞樣品、不消耗化學試劑、不污染環境的檢測技術。近紅外光譜法(NIRS)利用有機物中含有C-H、O-H、N-H 和S-H等化學鍵的合頻或倍頻振動，以漫反射方式獲得在近紅外區的吸收光譜，通過主要成分分析、偏最小二乘法等現代化學計量學的手段，建立物質光譜與待測成分含量間的多元線性回歸方程，實現利用近紅外光譜信息對待測成分含量的快速預測。近紅外光譜用于煙草[13-14]、茶葉的分類[15]與咖啡堿[16]，光導纖維探頭的出現，近紅外檢測技術可直接用于糧食或水果傳送帶上進行產品分揀[17-20]。近紅外檢測技術不僅作為常規方法用于食品的品質分析[21, 22]，而且已用于食品加工過程中組成變化的監控和動力學行為的研究[23]，如近紅外光譜技術在水產品檢測中的應用[24]；通過測定顏色變化來確定農產品的新鮮度、成熟度，了解食品的安全性[25, 26]；檢測蘋果、葡萄、梨果汁加工過程中可溶性和總固形物的含量變化[26-28]；通過可見-近紅外光譜技術(LS-SVM)判定蜂花粉的貯存時間[29]。【本研究切入點】目前雖然我國近紅外檢測技術的研究在某些方面較多，但在花粉活力上檢測還未應用。亟需基于近紅外光譜反射技術的碭山酥梨花粉活力快速檢測研究。【擬解決的關鍵問題】采用近紅外檢檢測方法對碭山酥梨花粉活力進行檢測，得到快速檢測花粉活力的方法，分析研究基于近紅外光譜反射法快速檢測碭山酥梨花粉活力的可行性，為工業化生產花粉提供快速檢測依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

以2017年3月安徽碭山縣果紅豐花粉有限公司當年生產碭山酥梨花粉(花粉生產提純后即干燥低溫-20℃下貯藏，花粉活力下降速度較緩)為研究對象。將200 g花粉混合后封裝在20個紙質包裝中，放在4℃下貯藏(花粉活力下降速度相對較快)。以花粉從-20℃轉入-4℃儲藏的日期為活力下降的起點，即6月7日(0 d)、6月14日(7 d)、7月4日(27 d)、7月20日(43 d)與8月11日(65 d)。將20個花粉樣品取出室溫蘇醒6 h后，進行近紅外光譜掃描及花粉活力測定。測定完成后繼續放入4℃下貯藏。

1.2 方 法

1.2.1 近紅外光譜掃描

用丹麥FOSS公司生產的NIRSystems Lab 5000型近紅外分析儀進行樣品的光譜采集。具體方法參照徐葉挺[30]利用近紅外光譜采集花粉光譜方法。

1.2.2 花粉活力

參照徐葉挺[30]測定扁桃花粉活力方法。

不同活力花粉中含H鍵有機物含量變化是影響光譜變化的主要原因。采用多元線性回歸、主成分回歸和偏最小二乘法等定量校正方法來建立不同花粉活力的定性定量模型。在建立光譜模型時，采用全局中心馬氏距離(globalhood，GH)和“T”檢驗進行兩輪異常值的剔除，其中中心馬氏距離GH≥10剔除光譜異常值，T檢驗>2.5剔除化學異常值。經過對的100個不同活力花粉光譜圖異常值剔除后，剩余99個光譜數據進行定標模型的建立。

近紅外定標模型優劣的參數：決定系數(R2)、定標標準差(SCE)、交互驗證標準差(SECV)、交互驗證相關系數(1-VR)等。使用不同光譜預處理方法可得到不同的近紅外模型，以最高的交互驗證相關系數(1-VR)和最低的交互驗證標準差(SECV)為標準，來確定并選擇最佳定標模型。并利用AACC39-00對近紅外預測模型進行判定，即驗證相對分析誤差RPDCV(RPDCV=SD/SECV)。當驗證相對分析誤差RPDCV≥3.0，則定標方程預測效果極準確；當RPDCV≥2.5時，該定標方程可用于日常分析檢測。當RPDCV在2.0～2.5，則預測方程可接受，但預測準確度不佳。當在2.0以下，方程預測準確度較差。

以花粉活力與波段光譜反射率的相關性分析結果為依據，選取相關性最強的3個波段進行組合，即R1540+R1956、R1540+R2438、R1956+R2438、R1540+R1956+R2438等4種方式，將不同花粉活力對應的反射率進行算術相加、算術相加后取對數、各自取對數后相加3種數學處理，所得的數據作為自變量，以花粉活力為因變量，建立Asymptotic1、SRichards1、ExpAssoc模型。

1.3 數據處理

采用Statistica5.0對梨花粉不同時間測定的活力值進行方差分析。通過WinISIⅢ近紅外定標軟件，利用花粉活力值及近紅外光譜圖進行定標模型的建立，根據定標模型參數判斷該模型的準確度。不同花粉活力與光譜反射率的相關性分析、作圖與模型擬合采用Origin2016完成。

2 結果與分析

2.1 碭山酥梨花粉活力定標集的活力差異

研究表明，在4℃貯藏下，隨著貯藏期的延長，花粉活力呈下降趨勢。梨花粉在以6月7日為起點(0 d、20份測定值)、6月14日(7 d、20份測定值)、7月4日(27 d、20份測定值)、7月20日(43 d、20份測定值)與8月11日(65 d、20份測定值)。其平均花粉活力分別為70.6%、60.3%、57.1%、53.2%與34.1%，標準差分別為±3.89%、±4.24%、±6.43%、±6.99%與±8.40%。從開始貯藏活力的70.6%降到34.1%，與開始儲藏時相比活力下降了52%，且不同貯藏時間下的花粉活力相互差異均顯著。100份梨花粉活力測定值定標集。圖1

注：不同字母表示LSD測驗下在P<0.05水平下差異顯著

2.2 碭山酥梨花粉活力近紅外光譜預處理

研究表明，不同花粉活力的近紅外光譜圖在光譜形狀也存在差異，有Y軸漂移較大，吸收峰疊加嚴重現象。光譜吸收峰得到增強，光譜差異更加顯著，校正了Y軸基線漂移現象。經導數處理與去散射方法結合處理光譜后，消除了光譜去散射的影響，使不同花粉活力的光譜平行移動得到改善。近紅外光譜是由分子振動從基態向高能級躍遷時產生的，主要反映的是含氫基團X-H(如C-H、O-H、N-H、S-H等)振動合頻的和倍頻吸收。近紅外光譜的合頻吸收位于2 000～2 500 nm，一級倍頻位于1 400～1 800 nm，二級倍頻位于900～1 200 nm，三級和四級或更高級倍頻則位于700～900 nm。在1 410～1 450 nm處C-H(CH3、CH2)是組合頻2ν+δ，1 920～1 980 nm處C=O、3ν倍頻，1 940～1 960 nm處游離的-OH組合頻ν+2δ和3δ，C-H、CH3、CH2組合頻ν+δ。圖2

注：SNVD既標準正態變量校正結合去除趨勢，圖2-a花粉近紅外反射原始光譜圖；2-b 導數處理1，4，4，1結合SNVD下的光譜圖

2.3 碭山酥梨花粉活力近紅外定標模型的建立與驗證

研究表明，近紅外預測模型較優，其交互驗證標準差SECV值為2.630，交互驗證相關系數1-VR值為0.953，RPDCV值為4.632>3.0，定標預測效果驗證準確，可進行日常檢測分析。表1

表1 不同光譜預處理下的梨花粉活力定標模型參數

2.4 碭山酥梨花粉活力與不同波段光譜反射率的相關性

研究表明，梨花粉活力與其光譜反射率在近紅外光波段均呈正相關性，在1 950～1 960 nm下相關性為0.813，1 520～1 566 nm下相關性為0.790～0.793，2 432～2 444 nm下相關性為0.768。在多個不同的波段都有相關性均大于0.6，即不同波長下對應的含氫集團發生了變化，這些變化與花粉活力發生變化呈相關。花粉活力改變的實質是花粉本身發生了特定的生理生化的變化，這些變化對應的含氫集團發生變化，被近紅外光譜儀捕捉后反映在不同波長下的反射率中。圖3

圖3 不同波長下近紅外光譜反射率與花粉活力的相關性

2.5 碭山酥梨梨花粉活力的估算模型

研究表明，擬合后R2均能達到0.946 8以上，其中以算術相加后取對數作為lg(R1540+R1956)自變量，ExpAssoc模型擬合度達0.999 8，擬合效果較好。表2

表2 梨不同花粉活力與光譜變量的函數關系

3 討 論

花粉在貯藏期間持續不斷進行呼吸等新陳代謝活動，同時消耗有機酸和可溶性糖等營養物質，花粉中所含有的蛋白質、酶、核酸及其它的物質在儲藏的過程中極易變性，導致花粉的生活力下降直至喪失[1]。花粉活力可以通過花粉中過氧化物酶的活性，呼吸代謝中的還原酶，花粉粒內的淀粉著色，花粉體內的酯酶作用能產生熒光的極性物質熒光素，脫氫酶的活性，花粉管長度來判斷花粉的生活力。這些方法是利用花粉體內的酶，或者代謝物質，或者是花粉本身所含有的基礎物質[9]。利用花粉呼吸作用或者電導率測定[6]，依據胞質是否具有酶活性進行的染色測定[7]，花粉離體萌發測定[10]，形成有效種子能力的測定。這些花粉活力測定的實質可能是花粉在呼吸作用或者其它的生命活動中，進行能量的傳遞與轉化，其保持活力的物質在低溫下可以緩慢的降解或者轉化。生命勢能在貯藏時間的加長而出現損耗。作為一個帶有遺傳物質的單元，自我啟動的能力降低以至于不能萌發而死亡。通過研究利用近紅外測定花粉活力，對花粉代謝作用進行全方位的掃描測定，所得的結果比起花粉活力單一途徑及過程中物質測定的準確率高。從開始貯藏活力蛋白質的42.21 mg/g增加到44.64 mg/g，蛋白質增加2.43 mg/g，增加5.8%。花粉活力與脂肪r為0.623，花粉活力與硫甙r為0.813；花粉活力與含水量r為-0.886，花粉活力與蛋白質r為-0.807。碭山梨花粉活力與脂肪、硫甙、含水量與蛋白質之間均有相互關系。

物質的近紅外光譜由物質的組成和結構決定。其組成和結構與近紅外光譜之間有一定的函數關系[20]。現在，近紅外光譜技術(NIRS)已經在食品、藥品、化學品等多個領域得到了廣泛的應用[24]。近紅外檢測技術在動植物內含物上的應用。煙葉中27種包括鈣、鎂元素化學成分[14]。卷煙中的焦油、煙堿和一氧化碳釋放量[13]。紫花苜蓿的粗蛋白和粗纖維。奶牛精料補充料中的化學成分及可消化總養分[22]。山藥中多糖。高粱中的總酚、縮合類單寧以及3-脫氧花青素含量。葡萄糊狀物中麥角固醇含量。果蔬基質中果膠的甲酯化程度[25]。大豆樣品水分、灰分、蛋白質以及脂肪含量[21]。研究對花粉活力的近紅外測定其實質也是對花粉活力的組成與結構進行分析得到定量的結果。其花粉活力定標模型相關系數R2為0.985，交互驗證相關系數1-VR為0.952 9，其活力測定的交互驗證標準差SECV為2.5%。利用近紅外反射技術快速測定花粉活力可行。

碭山梨花粉顆粒的個頭均較小，通常一個梨花粉有43.61～47.85 μm。在使用離體萌發法時，在顯微鏡下觀察到的花粉只是花粉群體當中的一小部分。進行顯微鏡下觀察花粉活力時，由于不同花粉活力在蛋白、脂肪、硫甙等內含營養物質含量不相同[30]，需要多次重復的均值才能表示花粉活力的生理現象[30]。對于研究中每個貯藏時間后的花粉活力，均是由多個數據的平均來代表。由于實驗中使用的近紅外光譜儀是樣品杯是圓形的，充填著大量的花粉粒。近紅外光譜掃出不同花粉活力時的近紅外譜線，掃描近紅外譜線代表的是這次花粉的整體活力。研究使用的花粉活力的均值代表不同貯藏時間的花粉活力。擬合的碭山梨花粉活力與近紅外光譜有函數關系，方程R2為0.985，1-VR為0.952 9，其活力測定誤差SECV為±2.5%。

4 結 論

4.1采用近紅外光譜快速預測碭山酥梨花粉活力，其定標模型相關系數R2為0.985，交互驗證相關系數1-VR為0.952 9，其活力測定的交互驗證標準差SECV為2.5%。利用近紅外反射技術快速測定花粉活力可行。

4.2碭山酥梨花粉活力與其光譜反射率在近紅外光波段均呈正相關性，在1 950～1 960 nm下相關性為0.813，1 520～1 566 nm下相關性為0.790～0.793，2 432～2 444 nm下相關性為0.768。通過3種數學處理后的變量擬合的Asymptotic1、SRichards1、ExpAssoc模型，擬合后R2均能達到0.946 8以上，其中以算術相加后取對數作為lg(R1540+R1956)自變量，ExpAssoc模型擬合度達0.999 8。3個波段組合的4種方式以SRichards1模型擬合效果均較好，擬合方程的R2均大于0.992 1。