酶@金屬有機框架復合材料的設計策略*

童琳凈，黃思銘，陳國勝，歐陽鋼鋒

1. 生物無機與合成化學教育部重點實驗室/中山大學化學學院，廣東 廣州 510006

2. 廣州醫科大學藥學院，廣東 廣州 511436

酶是一種具有高效催化功能的生物大分子，可維持復雜的細胞網絡之間的有序通訊及信號即時反饋［1］。模仿或利用天然酶的催化特性在藥物設計、傳感設備開發和生物醫學工程等研究領域中均具有重要的應用前景［2］。然而，酶對溫度、酸堿度波動、有機溶劑和小分子抑制劑等環境因素敏感，受到這些外界刺激時，酶的構象會發生不同程度的擾亂或活性中心結構直接被破壞，導致催化活性大大降低甚至消失?？梢哉f，酶的脆弱性極大地限制了其在實際應用的效率。為提高酶的工作穩定性，近年來科學家們致力于尋找合適的多孔載體（包括無機氧化物、納米粒子、多孔碳材料等）對酶分子進行結構固定。研究證實通過合理的材料固定化有助于酶三維結構的維持，提高其在變性環境下的穩定性，并展示連續循環催化的優點［3］。然而，傳統多孔材料通常表面積低，且孔徑尺寸難以調控，導致酶固定化方法存在加載量低、結構束縛不緊密和容易浸出等缺點。

金屬有機框架（MOFs，metal-organic frameworks）是由有機配體和金屬節點（金屬離子或金屬團簇）連接成的延展性網絡框架。不同的節點（node）和聯接橋（linker）可組裝形成多種多樣結構的MOFs，而框架豐富的官能團又賦予其靈活的加工特性，目前已有超過20 000 種MOFs 被報道［4］。MOFs具備超高的孔隙率、可調控的孔道尺寸、優異的化學及熱穩定性等優點，不僅在氣體分離、存儲和催化等傳統研究領域備受關注，在酶固定化領域的研究也大放異彩［5］。首先，超高的孔隙率可大幅度地提高酶的負載效率，而可調控的孔道特性有利于裁剪出與酶尺寸匹配的固定空間；其次，優異的化學及熱學穩定性賦予酶@MOFs復合材料更高的耐受性及循環利用率。

酶的表面具有多樣的氨基酸殘基及豐富的電荷特性，容易與MOFs表面或者內部孔道化學成分產生多種相互作用，包括范德華力、疏水相互作用、π-π 相互作用、靜電力、共價作用等。因此，容易形成穩定的酶@MOFs 復合結構。根據酶固定方式及空間分布，可將固定策略大致分為以下3類：1）基于物理吸附或化學鍵合的表面固定；2）后滲透的孔道固定；3）原位包埋的孔道固定。不同的固定化方式會對酶結構產生不同程度的束縛效果，提高酶的工作穩定性；同時，材料的化學組分及固定模式賦予酶的活性中心不同的微環境，有望提高甚至改變酶的生物功能［6］。本文綜述了基于表面連接、滲透、原位包埋的3 種酶@MOFs固定化策略，著重強調不同固定模式的適用范圍及穩定化特性，并對酶@MOFs 固定化研究的發展進行展望。

1 表面連接

基于表面連接的酶固定化方式是指酶通過物理及化學作用固定于MOFs表面。這種固定方式不依賴于MOFs 的孔道結構，設計簡單、可操作性高。最簡單、常見的表面固定化策略是基于物理吸附作用的固定，例如，右旋乳酸脫氫酶（DLDH）通過范德華相互作用、疏水作用以及原子間的氫鍵作用負載于Fe3O4NPs@Ni-MOF。固定后D-LDH 可保持其天然構象，并獲得更高的溫度及酸堿性穩定性［7］。物理吸附由于界面作用力較弱，很容易出現酶滲漏的問題，通過結合力更強的共價作用是更理想的表面固定方式。例如，Wang等［8］通過EDC/NHS 交聯方式將α-L-鼠李糖苷酶（Rha） 固定于磁性ZIF-8 納米粒子，利用EDC/NHS 交聯法固定形成Rha@ZIF-8， 得到的Rha@ZIF-8 的酶活性為25.09 U/g，催化速率常數Km值低于游離Rha。Rha@ZIF-8也顯示出了顯著提高的可重用性，在60 ℃下循環30 次后，轉化率仍為73.55%；大豆環氧化物水解酶（sEH）通過化學交聯的方式被固定在尺寸均勻分布在350～400 nm 的納米/微尺度UiO-66-NH2上，酶負載達87.3 mg/g（圖1a）。所得到的新型納米/微生物催化劑sEH@UiO-66-NH2結構剛度顯著增強，酶活性回收率達88.0%［9］。此外，有少量研究發現氨基酸有望作為配體，參與MOFs材料的組裝。如，L-天冬氨酸和鋯簇可組裝形成一種3D 微孔MOFs 材料，MIP-202（Zr）（圖1b，c）。這種氨基酸MOFs 繼承了傳統UiO-66 的拓撲結構，并具有出色的化學穩定性［10］。雖然目前還沒研究發現能否通過氨基酸直接配位的方式實現酶的固定，但氨基酸的配位潛力無疑為酶的表面固定策略提供了新思路。

圖1 表面連接法的酶固定化示意圖Fig.1 Schematic representation of enzyme immobilization by surface linking method

基于表面連接的酶固定化策略設計簡單、可操作性高，大部分的MOFs均可以通過該方法作為酶的載體，得到的復合材料具備較好的生物活性和穩定性。但這種固定化方式忽視MOFs的高孔隙利用率的特性，固定位點主要來自有限的表面區域，因此酶負載效率通常較低。此外，僅僅利用MOFs 表面與酶連接對酶的保護作用并不強，難以在惡劣環境條件下（水解酶、高溫、有機溶劑等）持續工作。

2 滲透法

MOFs 具超高的孔隙率和可調控的孔道尺寸，充分利用MOFs的孔道結構必然會提高酶的加載效率，并提供更緊密的束縛環境?；跐B透方式的孔道固定方法是酶固定的重要的策略之一。在這個過程中，酶通過滲透的方式進入MOFs 的孔道，并通過化學或物理作用固定于MOFs孔道內。這種策略需要對MOFs 的孔道進行精心的設計：1）孔道結構與酶尺寸的匹配，保證酶分子的順利進入；2）孔道-酶的界面的作用，防止酶分子的浸出。酶是生物大分子，往往具有數納米的分子尺寸，適用于后滲透孔道固定的MOFs 需要具備介孔的孔道。

南弗羅里達大學馬勝前教授團隊［11］證明微過氧化物酶-11（MP-11，3.3 nm×1.7 nm×1.1 nm分子尺寸）可滲透并固定于Tb-meso-MOF的介孔孔道（3.9 nm 和4.7 nm），與介孔二氧化硅材料MCM-41 固定的酶相比，MP-11@Tb-meso-MOF 表現更優越的酶催化性能。值得注意的是，相對尺寸較大的酶也有可能滲透、固定于孔道尺寸稍小的MOFs 中。如，細胞色素C（Cyt c）是一種重要的血紅素蛋白，分子尺寸約2.6 nm×3.2 nm×3.3 nm。Cyt c 可成功滲透進入具有直徑為1.3 nm 和1.7 nm的Tb-meso-MOF 孔道里，在該過程中，Cyt c 會打開部分三級結構形成一個既不同于其天然構象也不同于變性蛋白的構象［12］。這項發現為蛋白質的轉移及MOFs 孔道的大分子固定提供了新見解。NU-1000 是由鋯簇（Zr6（m3-OH）4（m3-O）4（OH）4（OH2）4）和羧酸配體（1，3，6，8-tetrakis（p-benzoate）pyrene）鏈接形成的層次型介孔MOFs（～3 nm 介孔和1.2 nm 微孔），具有優異的化學和熱穩定性。NU-1000 及具有類似拓撲結構的NU-100X 系列（3.3 ～ 6.7 nm 介孔，X=3，4，5，6，7）是十分理想的酶固定載體［13］。胰島素（1.3 nm × 3.4 nm × 1.3 nm）通過擴散進入NU-1000 介孔孔道，30 min 內達到～40%（w）的高負載率（圖2a）。NU-1000 堅實的多孔保護層提高胰島素在胃蛋白酶中的耐受性，并實現PBS響應的胰島素釋放（圖2b）［14］。

圖2 滲透法合成酶@MOFs示意圖Fig.2 Schematic representation of enzyme encapsulation in MOFs by the infiltration strategy

酶固定于MOFs孔道后，接觸界面組分容易發生相互作用，改變酶的結構或活性中心的微環境。研究發現Cyt c 滲透并固定于NU-1000 后，活性中心周圍的氨基酸位置會發生顯著改變，對2，2-偶氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）展示出比游離Cyt c 更高的氧化性能（圖2c）［15］。這種界面作用誘導的結構擾亂現象為設計高活性、高穩定性的酶@MOFs平臺提供了新的方向。

相比于表面固定策略，后滲透的孔道固定策略具有明顯的優點，主要體現在酶加載效率和穩定功能的提升。但目前絕大多數MOFs的孔道是微孔的，適用于這種固定方式的介孔MOFs載體十分有限。此外，理想的MOFs載體的孔道尺寸應盡可能和酶分子尺寸相匹配；反之，容易造成酶負載量的下降，并加劇酶浸出的風險［16］。因此，后滲透的孔道固定策略對MOFs孔道設計要求嚴格。

3 原位包埋

為了克服對MOFs孔道結構的高度依賴，原位包埋的固定策略應運而生。原位包埋是在酶表面原位生長MOFs 結構，故這種新型的“一鍋組裝”策略不受MOFs孔道結構和尺寸的影響。在這種固定過程中，酶會直接與MOFs前驅體接觸，要求組裝環境具有良好的生物相容性。該固定方式可以根據組裝是否引入模板分為模板法與非模板法。

3.1 非模板法

ZIFs 系列，如MAF-4［17］（ZIF-8）、ZIF-67 等MOFs 組裝條件溫和，在常溫和水相環境下即可組裝，因此是十分理想的原位包埋載體。這一概念最早在2014 年被清華大學Liu zheng 團隊［18］提出，在Cyt c 和ZIF-8 前軀體的混合溶液中，Cyt c 會通過共沉淀的方式進入正在生長的ZIF-8 的空腔，得到ZIF-8-包埋的Cyt c 結構。隨后受自然生物礦化過程啟發，原位誘導MOFs在酶表面結晶成為另一種主流的原位包埋方法（圖3a）［19］。生物界面與金屬節點（團簇）之間的強相互作用是生物礦化的關鍵因素，豐富負電荷表面性質的酶有利于金屬陽離子的蓄積，誘導原位礦化［20］。因此，這種策略對于酶表面化學性質有一定要求。本課題組提出一種氨基酸增強的仿生礦化策略，可快速、高效地將不同表面化學性質的蛋白質和酶封裝在MOFs 內。這種增強的封裝策略靈感來源于生物體內金屬巰基蛋白對金屬離子的富集作用，半胱氨酸、聚乙烯吡咯烷酮和蛋白質形成類似于金屬巰基蛋白模型的自組裝體可促進金屬離子在蛋白質周圍富集，加速ZIF-8 的預先成核（圖3b）［19，21］。此外，我們還開發了一種簡單的聚多肽導向原位組裝策略，制備出系列具有不同2D或3D納米結構的高活性酶@ZIF-8 生物雜交材料［22］。研究表明不同的納米結構對于雜交材料的活性有重要影響，其中設計的介孔2D酶@ZIF-8納米片結構由于具有更短的底物擴散路徑和更大的孔道尺寸，有助于提高酶活性位點的利用率，因此具有更高的生物活性。值得注意的是，不同的原位封裝模式［23］及ZIFs 骨架的親疏水性質［24］可能對酶@ZIFs 復合材料的活性均具有重要的影響，原位組裝過程需要充分考慮這些因素。

圖3 仿生礦化法合成酶@MOFs示意圖Fig.3 Schematic representation of the procedure for enzyme encapsulation in MOFs by the strategy of biomimetic mineralization

在原位包埋的策略中，ZIFs 的微孔結構可緊密束縛酶的構象，大幅度提升酶的穩定性。例如，大量研究證實酶@ZIFs 材料在有機溶劑、水解酶、高溫等惡劣條件處理后仍能維持十分高的生物活性［18-26］。但由于微孔ZIFs 外骨骼對底物擴散抑制作用，酶@ZIFs材料的活性往往不夠理想，但也有反常的現象被報道。如Guo 等［27］將Cyt c 包埋于生長在TiO2納米通道的ZIF-8 內，通過量子力學計算結果發現ZIF-8 結構的限制作用會導致Cyt c 的Fe-S鍵傾向于斷裂，提高Cyt c的過氧化物酶活性。

3.2 模板法

模板法是指酶預先與模板混合或組裝，隨后構建MOFs 保護層，最后去除模板得到酶@MOFs結構。模板在組裝過程中為脆弱的酶分子提供庇護作用，減少酶在組裝過程中的失活風險。Huo 等［28］預先將蛋白質加載于UiO-66/Fe3O4穩定的瓊脂糖水凝膠液滴，隨后在液滴表面生長ZIF-8外殼，達到原位包封效果。得到的復合結構堅固，高度微孔，水凝膠核心提供了一個簡單的基底誘導酶@MOFs的組裝。

目前適用于原位包埋固定的MOFs基質主要是微孔的ZIFs 系列，但微孔的孔道會阻礙底物與內部酶的接觸，抑制酶的生物活性。模板分子的引入-去除過程往往產生獨特的層次孔結構，提高酶的可利用率。Cheng 等［29］以水凝膠為模板，采用模板乳化法制備鋅離子均勻分布的分層微孔和介孔鋅基MOFs，用于葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶的原位封裝（圖4a），其穩定性和酶活性顯著提高，kcat/km值比溶液中游離酶的值高7.7 倍，在Knoevenagel 反應中也具有更高的催化活性。相比水凝膠等軟模板，硬模板法構建層次結構的酶@MOFs 材料也正在開發。如Chen 等［30］將過氧化氫酶（CAT）預先封裝于結構不穩定的ZIF-67 微晶中，在此結構上進一步生長ZIF-8 外殼，通過水刻蝕即可去除不穩定的ZIF-67 核，形成中空的CAT@ZIF-8 結構（圖4b）。這種中空結構減少了酶-ZIF-8界面相互作用，提高包埋的酶的自由活動度，因此中空CAT@ZIF-8的活性顯著提升。

圖4 模板法合成酶@MOFs示意圖Fig.4 Schematic illustration of the preparation of enzyme@MOFs via a templated method

4 總結與展望

MOFs 具有豐富的化學組分、極高的孔隙率和可調的孔道尺寸，基于表面連接、后滲透和原位包埋等固定模式能設計出不同結構性質的酶@MOFs 復合材料。利用酶-MOFs 界面的相互作用及MOFs外骨骼提供的保護功能，酶在穩定性、重復利用性甚至活性等方面均有不同程度的改善。目前，該固定技術在納米醫學［31］、生物催化［32］、藥物傳遞［33］等領域已表現出重要的應用前景。相比于早期的表面連接和后滲透等固定策略，原位包埋方法設計的MOFs 載體對酶的結構束縛更緊密，穩定性更高。同時，致密的微孔網絡可更有效地防止酶浸出，提高酶的循環利用性。但該方法處于早期研究階段，仍存在較大的提升空間：1）大部分MOFs 的合成條件苛刻（強酸及有機溶劑使用、高溫、高壓等），酶極易在組裝過程中失活或變性。目前，已有其他生物相容的組裝策略正在發展中，如固相機械組裝策略有望降低酶在包埋過程中變性的風險［34］；2）原位包埋法最常用的ZIFs 系列材料對酸敏感，合成的酶@ZIFs 材料應用范圍受限；3）酶和MOFs 的界面作用方式、酶在MOFs內的空間規律以及如何調控等關鍵科學有待深入研究。