短梗五加果實不同發(fā)育階段特異性代謝特征

邵文達，吳可心，任艷君，劉昱利，孫菲陽，唐中華

（東北林業(yè)大學 a.化學化工與資源利用學院；b.林學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

短梗五加Eleutherococcus sessiliflorus，又稱無梗五加，民間俗稱“烏鴉子”，是五加科Araliaceae五加屬Eleutherococcus藥用植物，屬多年生落葉灌木或小喬木，常叢生或散生于針闊葉混交林或闊葉林中。短梗五加主要分布于我國的東北、內(nèi)蒙古、河北、山西地區(qū)及朝鮮、俄羅斯遠東地區(qū)[1]。由短梗五加的根、莖、葉、果等部位提取分離出的活性成分含量及其相關功能各不相同。短梗五加的根、莖中富含黃酮類、木脂素類活性成分，其根皮俗稱“五加皮”，為民間常見中藥，性溫，味辛、苦，歸肝、腎經(jīng)，具有抗疲勞、抗癌、保肝護肝、消炎、安神等功效[2]。短梗五加葉、果中的揮發(fā)油、有機酸類、色素等活性成分則被廣泛應用于醫(yī)藥及食品深加工領域[3]。短梗五加果被原國家衛(wèi)生部列為食品新資源，是一種藥食同源食品，含有黃酮、多糖、維生素、礦物質(zhì)、必需氨基酸、花青素等成分。短梗五加果實性溫，無毒，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、保肝[4-5]、改善睡眠、降血脂、預防心血管疾病[6]、平衡陰陽、補腎強腰等多種功效，是新型保健食品的優(yōu)質(zhì)原料[7]。短梗五加的嫩莖俗稱“刺拐棒”或“綠參”，其嫩莖葉常被作為山野菜。

與同科屬其他植物相比，短梗五加的特定部位還含有一些特色功能性成分，這些活性成分的分離、鑒定及藥理分析對該科屬植物的深入研究具有重要的參考價值[8-9]。短梗五加果實中富含的活性物質(zhì)有金絲桃苷、刺五加苷B、刺五加苷E、齊墩果酸、異嗪皮啶等。金絲桃苷是短梗五加等五加屬植物中的重要活性物質(zhì)，具有降血糖、降血脂[10]、鎮(zhèn)靜、抗抑郁[11]等藥用功效，同時還具有一定的抗癌作用[12]。刺五加苷為五加屬植物中含量較為豐富的特異性成分，主要有刺五加苷B（紫丁香苷）、刺五加苷E 等，具有強效的緩解身心疲勞的作用[13]。相關研究結(jié)果證明，刺五加苷B具有一定的消炎、鎮(zhèn)痛、保肝護肝、抗腫瘤等功效[14-17]，刺五加苷E 具有預防細胞脂質(zhì)聚積[18]、促進睡眠、鎮(zhèn)靜安神等功效。齊墩果酸具有一定的抗血栓、抗血小板凝集活性[19]，而且其因具有良好的抗氧化性及保肝護肝功效在食品、醫(yī)療領域日益受到關注。異嗪皮啶具有鎮(zhèn)靜、抗腫瘤及抗氧化等功效[20-21]。

果實中糖和有機酸等代謝組分及其含量水平是果實品質(zhì)的重要影響因素。在果實生長發(fā)育過程中，糖及其活化形式為果實多種代謝過程提供底物、中間反應物和能量等，形成果實風味等[22-23]，糖還為果實細胞膨大提供滲透推動力[24-25]。有機酸通常在果實生長過程中積累，在果實成熟過程中作為糖酵解、三羧酸循環(huán)等呼吸基質(zhì)（ATP 來源）以及糖異生作用基質(zhì)而被消耗[26]。了解短梗五加果實類型，研究短梗五加果實發(fā)育過程中的糖和酸代謝及其變化規(guī)律，對于研究提高短梗五加的果實品質(zhì)具有重要意義。

20世紀90年代，代謝組學作為一門全新學科逐漸發(fā)展起來[27]。近年來，代謝組學發(fā)展十分迅速，目前已經(jīng)成為植物生物學研究的一個重要領域[28]。植物代謝組學主要采用4 種分析技術：核磁共振譜、毛細管電泳色譜質(zhì)譜聯(lián)用、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用[29]和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用[30]。目前，代謝組學分析在果實生物學研究中被廣泛應用，例如，在枇杷[31]、藍莓[32]、蓮霧[33]、臍橙[34]等果實發(fā)育成熟過程中代謝過程及所參與化合物等的變化的研究中得以應用。目前，對短梗五加根、莖、葉的研究報道頗多，但對其果實的生長形成以及發(fā)育成熟代謝的研究報道較為鮮見。文中以短梗五加果實為研究對象，利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術對不同時期短梗五加果實代謝產(chǎn)物進行分析，并對5個時期的差異代謝物進行了篩選，旨在為提高短梗五加果實品質(zhì)提供參考，為短梗五加果實資源的合理利用及相關產(chǎn)品的高效開發(fā)提供思路。

1 材料與方法

1.1 材 料

以東北林業(yè)大學化學化工與資源利用學院（126°37′47.24″E，45°44′1.61″N）栽培的5年生短梗五加（約65 株）為樣株。分別于2020年8月25日、8月31日、9月16日、9月22日、10月19日，在短梗五加樣株的東、西、南、北方向，隨機采摘無病蟲害且大小基本一致的果實，混樣，重復至少3 次，經(jīng)液氮速凍后-80 ℃條件下保存。

1.2 樣品制備

初級代謝和次級代謝樣品的制備以及色譜、質(zhì)譜條件參照劉洋[35]的方法，將衍生樣品以液體形式注入Agilent 7890A-5975C GC-MS（gas chromatography-mass spectrometry）系統(tǒng)（美國安捷倫公司），以高純氦為載氣進行分離，恒定流速為1.0 mL/min，注入溫度和離子源溫度分別設置為260、230 ℃，模型為電子碰撞電離（?70 eV），采用全掃描模式分析初級代謝產(chǎn)物。采用UPLC-MS（ultra-high liquid chromatograph-mass spectrometer）分析次生代謝產(chǎn)物，將獲得的數(shù)據(jù)進行分析和歸一化處理，用峰面積的標準曲線測定化合物的含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Agilent GC-MS 5975 數(shù)據(jù)分析軟件處理數(shù)據(jù)，并使用XCMS 軟件包進行數(shù)據(jù)的特征峰提取和預處理，將預處理完畢的數(shù)據(jù)矩陣歸一化后導入SIMCA-P 13 軟件（Umet-rics，Umea，瑞典）進行PCA 和PLS-DA 等多元統(tǒng)計分析，再以變量對分組貢獻得分（VIP 值）大于1 和單因素方差分析結(jié)果顯著（P＜0.05）為差異性代謝產(chǎn)物的篩選標準。將差異代謝物輸入KEGG 數(shù)據(jù)庫和Metabo Analyst 數(shù)據(jù)庫（https://www.metaboanalyst.ca）進行代謝途徑的富集和篩選。GC-MS 代謝組學和LC-MS 代謝組學數(shù)據(jù)均使用Microsoft Excel 2019和SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計分析（采用單因素方差分析法），使用GraphPad Prism 8 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 短梗五加果實5個時期的性狀

根據(jù)果實的縱橫徑和顏色將果實生長發(fā)育過程分為5個時期（圖1），分別為幼果期（8月25日）、綠熟期（8月31日）、半轉(zhuǎn)色期（9月16日）、轉(zhuǎn)色期（9月22日）、成熟期（10月19日）。幼果期的果實小且硬；綠熟期的果實迅速膨大，顯現(xiàn)出品種特有的形態(tài)，果實整體較為飽滿；半轉(zhuǎn)色期的果實開始有色素沉著，這個階段的果實半青半紫；轉(zhuǎn)色期的果實整體呈現(xiàn)均勻的色素沉著，果粒完全呈現(xiàn)深紫黑色，果肉開始軟化；成熟期的果實一般用于制成可食用或藥用的干果。

圖1 5個發(fā)育時期的短梗五加果實Fig.1 Fruits of E.sessiliflorus at five developmental stages

2.2 短梗五加果實5個時期的活性物質(zhì)含量

短梗五加果實5個時期的活性物質(zhì)（刺五加苷B、刺五加苷E、金絲桃苷、異嗪皮啶、齊墩果酸）含量如圖2所示。由圖2 可見：在幼果期、綠熟期、半轉(zhuǎn)色期，5 種活性成分的含量基本穩(wěn)定，刺五加E質(zhì)量分數(shù)為0.02 ～0.04 μg/g，刺五加苷B 質(zhì)量分數(shù)為0.01 ～0.03 μg/g，金絲桃苷質(zhì)量分數(shù)為0.03 μg/g，異嗪皮啶質(zhì)量分數(shù)為0.003 ～0.005 μg/g，齊墩果酸質(zhì)量分數(shù)為155.85 ～217.65 μg/g；但是在轉(zhuǎn)色期、成熟期2個階段，5 種活性成分的含量顯著增加，刺五加苷E 質(zhì)量分數(shù)最高達到23.66 μg/g，是前期的1 000 倍，刺五加苷B 質(zhì)量分數(shù)最高達到1.63 μg/g，是前期的100 倍，金絲桃苷質(zhì)量分數(shù)最高達到3.12 μg/g，是前期的100 倍，異嗪皮啶質(zhì)量分數(shù)最高達到0.008 μg/g，是前期的2 倍，齊墩果酸質(zhì)量分數(shù)最高達到347.36 μg/g，是前期的2倍，并且其含量在5 種活性成分中是最高的。

圖2 短梗五加果實5個時期的活性物質(zhì)含量Fig.2 Active substances in five stages of E.sessiliflorus fruit

2.3 短梗五加果實5個時期的差異代謝物

2.3.1 差異代謝物的PCA 和PLS-DA 模型分析結(jié)果

對短梗五加果實5個時期代謝物累積的差異進行PCA 分析，得分情況如圖3所示。在第1 主成分中，短梗五加果實的幼果期、綠熟期、半轉(zhuǎn)色期、轉(zhuǎn)色期與成熟期明顯分開，在第2 主成分中，幼果期、綠熟期、半轉(zhuǎn)色期、成熟期與轉(zhuǎn)色期明顯分開。即幼果期、綠熟期、半轉(zhuǎn)色期與轉(zhuǎn)色期、成熟期明顯分開，說明短梗五加果實5個時期代謝物的累積有明顯差異。

圖3 短梗五加果實5個時期差異代謝物的PCA 得分Fig.3 PCA score of E.sessiliflorus fruit in five stages

但PCA 分析是一種無監(jiān)督的分析方法，不能忽略組內(nèi)誤差并消除與研究目的無關的隨機誤差。為更加準確地顯示短梗五加果實5個時期代謝物累積的差異，使用有監(jiān)督的PLS-DA 模型進一步進行分析，得分情況如圖4所示。經(jīng)PLS-DA 模型分析可知，擬合優(yōu)度系數(shù)R2和Q2分別為0.775、0.920，說明PLS-DA 模型的擬合結(jié)果穩(wěn)定、可靠。

圖4 短梗五加果實5個時期的PLS-DA 得分Fig.4 PLS-DA score of E.sessiliflorus fruit in five stages

2.3.2 差異代謝物的名稱

基于PLS-DA 分析結(jié)果，得到VIP 值大于1的化合物，再經(jīng)過單因素方差分析篩選P值小于0.05 的化合物，最終得到49 種差異代謝物（表1）。由表1 可知：篩選出的差異化合物中有7 種糖，分別是D-阿拉伯糖、D-半乳糖、吡喃半乳糖、乳糖、D-核糖、葡萄糖、纖維二糖；有23 種酸，分別是蘋果酸、奎寧酸、琥珀酸、檸檬酸、苯甲酸、沒食子酸、哌可酸、葡萄糖酸、戊酸、L-去甲纈氨酸、2-酮-1-葡萄糖酸、丙二酸、2-丙酸、4-羥基苯甲酸、丙炔酸、亞硫酸、3-羥基苯甲酸、戊二酸、醋酸、4-乙基苯甲酸、莽草酸、2-丁烯二酸、4-氨基丁酸；有4 種醇，分別是1-環(huán)戊烷硫醇、1,2-乙二醇、肌醇、甘油；其他15 種。

表1 短梗五加果實5個時期的差異代謝物（P ＜0.05）Table 1 Different metabolites of E.sessiliflorus fruit in five stages(P ＜0.05)

2.3.3 差異代謝物相對含量的聚類分析

短梗五加果實5個時期差異代謝物相對含量的聚類分析結(jié)果如圖5所示。由圖5 可見，幼果期積累最多的糖有D-阿拉伯糖、吡喃半乳糖，綠熟期積累最多的糖有葡萄糖，半轉(zhuǎn)色期積累最多的糖有D-核糖、D-半乳糖，成熟期積累最多的糖有吡喃半乳糖、纖維二糖、半乳糖。

圖5 短梗五加果實5個時期差異代謝物相對含量的聚類分析結(jié)果Fig.5 Cluster analysis of differential metabolites in five stages of E.sessiliflorus fruit

由圖5 可見，在短梗五加果實的青果期，即果實尚未完全變紫黑前，幼果期、綠熟期、半轉(zhuǎn)色期聚類的化合物主要是有機酸。在轉(zhuǎn)色期和成熟期有機酸含量下降，在幼果期積累較多的酸有檸檬酸、沒食子酸、莽草酸、奎寧酸、葡萄糖酸、2-丁烯二酸等，在綠熟期積累較多的酸有琥珀酸、葡萄糖酸等，在半轉(zhuǎn)色期積累較多的酸有奎寧酸、蘋果酸、2-丁烯二酸等，在轉(zhuǎn)色期積累較多的酸有戊酸、哌可酸等，在成熟期積累較多的酸有苯甲酸、2-丁烯二酸等。

2.3.4 差異代謝物的通路分析

利用KEGG 數(shù)據(jù)庫找到所有差異代謝物的KEGG ID，將這些ID 輸入Metabo Analyst 數(shù)據(jù)庫，通過代謝富集分析，共標注到7個較為重要的代謝途徑，包括半乳糖代謝、硫代謝、乙醛酸/二羧酸代謝、三羧酸循環(huán)、γ-氨基丁酸（GABA）代謝、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝、丙酮酸代謝，結(jié)果見表2。由表2 可知，7個代謝途徑中的P值均小于0.05。半乳糖代謝途徑中化合物總數(shù)是27，匹配數(shù)是5，P值小于0.01，參與的化合物有乳糖、D-半乳糖、葡萄糖、肌醇、甘油。三羧酸循環(huán)中化合物總數(shù)是20，匹配數(shù)是4，P值小于0.01，參與的化合物有檸檬酸、2-丁烯二酸、琥珀酸、蘋果酸。乙醛酸/二羧酸代謝途徑中化合物總數(shù)是29，匹配數(shù)是4，P值小于0.01，參與的化合物有檸檬酸、琥珀酸、醋酸、蘋果酸。硫代謝途徑中化合物總數(shù)是15，匹配數(shù)是3，P值小于0.01，參與的化合物有琥珀酸、醋酸、亞硫酸。丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝途徑中化合物總數(shù)是22，匹配數(shù)是3，P值小于0.01，參與的化合物有琥珀酸、2-丁烯二酸、4-氨基丁酸。丙酮酸代謝途徑中化合物總數(shù)是22，匹配數(shù)是3，P值小于0.01，參與的化合物有蘋果酸、2-丁烯二酸、醋酸。γ-氨基丁酸代謝途徑中化合物總數(shù)是17個，匹配數(shù)是2，P值是0.05，參與的化合物有琥珀酸、4-氨基丁酸。

表2 短梗五加果實差異代謝物參與的7個代謝途徑Table 2 Seven metabolic pathways involved in differential metabolites in the fruit of E.sessiliflorus

3 結(jié)論與討論

本研究中以幼果期、綠熟期、半轉(zhuǎn)色期、轉(zhuǎn)色期、成熟期共5個時期的短梗五加果實為材料，基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術，在5個時期的短梗五加果實中鑒定出糖類、氨基酸、有機酸、醇等49 種差異化合物。研究結(jié)果表明，在果實發(fā)育前期積累了較多的糖和有機酸，隨著果實發(fā)育成熟，糖分被消耗，有機酸降解并轉(zhuǎn)換為糖類和氨基酸等物質(zhì)。在果實發(fā)育過程中，主要參與的代謝途徑有半乳糖代謝、硫代謝、乙醛酸/二羧酸代謝、三羧酸循環(huán)、γ-氨基丁酸代謝、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝、丙酮酸代謝等。短梗五加果實中5 種活性成分刺五加苷E、刺五加苷B、金絲桃苷、異嗪皮啶、齊墩果酸的含量在轉(zhuǎn)色期、成熟期顯著增加。

果實發(fā)育時期的劃分一般是基于物候?qū)W信息，通過實地觀測果實的大小、顏色以及成熟狀態(tài)等而定。本研究中以楊楠[36]對藍靛果實發(fā)育時期的劃分為依據(jù)，根據(jù)果實發(fā)育的外部形態(tài)特點，將短梗五加果實的發(fā)育時期分為幼果期、綠熟期、半轉(zhuǎn)色期、轉(zhuǎn)色期、成熟期共5個時期。從其藥用活性成分含量的變化和代謝物的差異來看，短梗五加果實發(fā)育時期又可以分成2個階段：幼果期、綠熟期、半轉(zhuǎn)色期為第1 階段（青果期）；轉(zhuǎn)色期、成熟期為第2 階段。

果實中糖酸的種類、含量及其動態(tài)變化對果實風味的形成有重要的影響，是近年來果實品質(zhì)研究的重要方向，如：葉麗琴等[37]探討了歐李果實在不同發(fā)育階段的糖酸積累規(guī)律以及不同種類糖酸間的相關性，結(jié)果表明糖酸比隨果實發(fā)育呈指數(shù)函數(shù)變化趨勢；安嬌等[38]對軟棗獼猴桃果實中的糖酸進行了研究，發(fā)現(xiàn)隨著果實發(fā)育成熟，糖酸組分及其含量均發(fā)生了變化；魏國芹等[39]在測定甜櫻桃果實糖酸組分及其含量時，發(fā)現(xiàn)隨著果實發(fā)育，總糖含量整體呈上升趨勢，總酸含量呈先增加、后下降趨勢。本研究中，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術檢測了短梗五加果實發(fā)育過程中的初級代謝物，包括糖、有機酸、氨基酸、醇等，發(fā)現(xiàn)其中以糖酸積累為主。

在果實發(fā)育過程中，糖分可提供營養(yǎng)物質(zhì)。藍公毅等[40]的研究結(jié)果表明，山蒼子果實在發(fā)育過程中內(nèi)含物含量下降，是由于果實發(fā)育膨大過程中需要充分的營養(yǎng)供應，養(yǎng)分被消耗。在對油茶果實的研究報道中，湯佳[41]提到果實也含有葉綠素，可進行光合作用，積累糖分。本研究結(jié)果表明，短梗五加果實的糖分在前期積累，在轉(zhuǎn)色期含量降低，在成熟期又增加。這可能是因為前期短梗五加葉片和果實通過同化作用產(chǎn)生的糖分積累在果實中，為果實生長提供了物質(zhì)基礎，果實在發(fā)育過程消耗養(yǎng)分，糖分含量降低，成熟后期，植物枝梢或根部繼續(xù)向果實運輸糖分，淀粉和有機酸也會轉(zhuǎn)化為糖，而糖分的消耗相對較少，糖分積累下來。

果實中有機酸的組分及其含量是決定果實風味的重要指標。在果實發(fā)育期間，不同類型果實酸度的變化不同。大多數(shù)果實（如梨[42-43]、甜櫻桃[39]和柚[44]等）的有機酸含量在發(fā)育前期逐步增高，隨著果實成熟，有機酸含量下降。本研究結(jié)果表明，短梗五加果實中的有機酸主要為蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、奎寧酸、沒食子酸等。在前期，果實中積累了較多有機酸；隨著果實生長發(fā)育有機酸含量降低；果實成熟時有機酸含量略有回升。其原因可能是果實發(fā)育初期有機酸大量合成積累，隨著果實發(fā)育成熟，有機酸開始轉(zhuǎn)化為糖類、氨基酸等物質(zhì)，其降解大于合成，與前人的研究結(jié)果基本一致。

植物的代謝途徑具有多樣性，常見的代謝途徑有糖酵解途徑、三羧酸循環(huán)途徑、磷酸戊糖途徑、γ-氨基丁酸途徑等。其中，γ-氨基丁酸在植物中具有多種功效，可調(diào)節(jié)植物機體pH，促進代謝和生長發(fā)育，抵御逆境等，由于功能多樣，相關代謝途徑的研究報道也較多[45-46]。當植物體受到逆境脅迫或植物激素作用時，植物體內(nèi)GAD 酶被激活導致γ-氨基丁酸富集[47]。本研究結(jié)果表明，短梗五加果實在幼果期、綠熟期、成熟期大量積累琥珀酸和4-氨基丁酸，因此γ-氨基丁酸代謝也是此3個時期的重要代謝途徑。γ-氨基丁酸代謝在這3個時期活躍，可能是因為在果實成熟過程中γ-氨基丁酸代謝促進果實成熟，而且與硫代謝共同防御外界環(huán)境的不良影響。

采收時果實發(fā)育程度對其藥用成分組成及其含量具有顯著影響。壽旦等[48]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，山茱萸果實由青變紅直至成熟，其主要成分熊果酸、齊墩果酸含量逐漸降低至穩(wěn)定狀態(tài)，馬錢素含量則逐漸升高，因此傳統(tǒng)的山茱萸采收時間是合理的。本研究結(jié)果表明，在發(fā)育前期，短梗五加果實的5 種活性成分（刺五加苷B、刺五加苷E、金絲桃苷、異嗪皮啶、齊墩果酸）的含量基本穩(wěn)定，在轉(zhuǎn)色期、成熟期含量顯著增加，這種變化規(guī)律可能與短梗五加果實生長發(fā)育過程中次生產(chǎn)物的消長規(guī)律及其發(fā)育變化相關，但具體原因有待進一步研究。