60Co-γ輻照對葡萄3種病原真菌的抑制效果

王辰元，王 釩，徐 靜，李文靜，張秉乾，冉隆賢，b，甄志先，b

（河北農業大學 a.林學院；b.河北省林木種質資源與森林保護重點實驗室，河北 保定 071000）

葡萄嫩枝扦插是一種以夏季修剪下來的半木質化的葡萄新梢為扦插材料進行扦插繁殖的重要育苗方法，利用夏季枝量大、氣溫高、生長快的有利條件，可以達到廢物利用、快速育苗的目的[1]。采用這一技術繁育苗木，成本低廉，操作簡單，扦插成活率高，繁育速度快，能滿足生產中對苗木的大量需求，可為葡萄高產提供有力的保障[2]。但是，長期采用扦插繁殖的方法，容易造成病原菌隨著繁殖材料而遷移和擴散等問題，特別是在利于病害發生的環境條件和管理水平低下的情況下，會很快導致病害的發生，造成重大損失。目前，生產中主要使用化學藥劑對葡萄苗木、種條進行消毒處理，然而化學藥劑的長期使用，不僅會使植物產生抗藥性，更會導致環境的污染。采摘后的新鮮水果會遭到一些包括真菌及細菌在內的有害生物的危害，而葡萄鮮品上市期比較短，且葡萄的貯藏技術還不太成熟，葡萄的病害直接影響其品質和保鮮，故研究葡萄采摘后病害的種類及其防治方法，是葡萄保鮮貯藏、上架銷售、長途運輸中亟待解決的重要問題[3-4]。因此，為了減少化學藥劑的使用，保證扦插繁殖成活率，提高葡萄果實的防霉保鮮效果，需要探索安全高效的除害技術。

輻照技術已被應用于多個領域中，且產生了巨大效益，不僅能夠滅除病原菌和害蟲，還具有無化學殘留、全程無熱源和無添加劑的優點，并能快速地進行滲透性消毒。其中的60Co-γ 輻照技術在農業生產中主要應用于種子和枝條誘變、水果保鮮和糧食貯藏防蟲等方面[5-9]。趙藝璇等[10]對大花秋葵和錦葵的種子進行輻照處理，結果證明，輻照能促進種子萌發，同時能增強植物的抗逆性；陳春霞等[11]、何平等[12]、葉開玉等[13]采用γ 射線進行輻照處理，結果都獲得了表現優良的變異品種[11-13]。60Co-γ 輻照還是防治蟲害的有效手段，通過輻照谷類及其制品可以殺死害蟲及蟲卵或致其不育，因此，輻照可以解決因貯藏環境不適宜而導致的糧食蟲害問題。輻照也是果實保鮮的措施之一，低劑量的輻照能提高植物體內超氧化物歧化酶（SOD）的活性，降低其丙二醛（MDA）含量，有利于植物的正常生長代謝[14]。石彬等[15]、楊俊麗等[16]分別用低劑量的60Co-γ 輻照獼猴桃、草莓，均能延長果實的貯藏期，且對果實品質的影響都較小。王秋芳等[17]的研究結果表明，1 000 Gy劑量以下的電子束輻照對巨峰葡萄的品質無影響，劑量為700 Gy 的輻照可以使葡萄果實在貯藏初期的抗氧化能力增強，從而能延緩果實的衰老。關文強等[18]、Witbooi 等[19]、康芬芬等[20]采用60Co-γ輻照對葡萄進行保鮮處理，但他們在所用輻照的劑量和試驗結果方面均存在較大差異，因此，輻照技術對于葡萄主要病原真菌的抑制效果仍需深入研究。為此，本研究分別以巨峰葡萄1年生嫩枝和果實為試材，采用不同劑量的60Co-γ 輻照處理進行試驗，分析了60Co-γ 輻照處理對葡萄嫩枝和果實上主要病原真菌的抑制作用，旨在探尋一種新的除菌方法，從而為輻照除菌技術的推廣應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的植物材料為巨峰葡萄1年生嫩枝和果實，均采自河北省保定市滿城區南辛莊村葡萄園。

供試的菌種分別為葡萄灰霉病菌Botrytis cinerea、葡萄潰瘍病菌Botryosphaeriasp.和葡萄白腐病菌Coniella diplodiella，試驗所用菌種均由中國農業科學院植物保護研究所提供。

試驗所用60Co-γ 輻照的鈷源由北京大學技物樓鈷源實驗室提供，鈷源的輻照劑量率為30 Gy/min。

1.2 試驗方法

1.2.1 輻照處理對葡萄3 種病原真菌的影響試驗

輻照對病原真菌孢子萌發的影響試驗：配制濃度為105個/mL 的葡萄灰霉病菌、葡萄白腐病菌和葡萄潰瘍病菌孢子懸浮液，置于無菌離心管中，進行劑量分別為40、100、600、1 000、2 000 Gy的60Co-γ 輻照，每個菌株的輻照各設3 次重復，以不進行輻照的為對照。輻照后用移液槍吸取100 μL的孢子懸浮液均勻地涂布于PDA 平板上，于25 ℃的培養箱中培養10 h，在顯微鏡下觀察計數，并計算分生孢子萌發率。

輻照對病原菌菌絲生長的影響試驗：將葡萄灰霉病菌、葡萄白腐病菌和葡萄潰瘍病菌分別接種至PDA 平板上，于25 ℃的溫度條件下培養5 d 后進行60Co-γ 輻照，輻照劑量分別設為40、100、600、1 000、2 000 Gy，每個菌株的輻照各設3 次重復，以不進行輻照的為對照。將輻照過的菌株，取同樣大小的菌餅接種至新的PDA 平板上，在25 ℃的培養箱中繼續培養5 d，觀察并記錄其生長直徑。

1.2.2 輻照處理對葡萄嫩枝扦插成活率的影響試驗

從田間采取健康的1年生葡萄嫩枝，去除頂端部分，保留1 ～2 片半葉，上切口距離第1個芽的上方1 cm 左右平剪并封蠟，下切口在盡量靠近葉柄基部斜切，制成長度為10 ～15 cm 的插條。將處理好的枝條置于劑量分別為40、100、600 Gy 的60Co-γ 射線下輻照，每個處理各設3 次重復，每次重復各處理15個枝條，以未作輻照的枝條為對照。將輻照過的枝條浸泡于生根粉溶液后扦插，保持適宜的溫度、濕度和光照，觀察并記錄枝條成活情況，以確定60Co-γ 輻照葡萄嫩枝的適宜強度與時間。

1.2.3 輻照處理對葡萄嫩枝上病原真菌的抑制作用的觀測

選擇長勢一致、健壯的葡萄綠枝條，剪去枝條上的葉片，修剪成10 ～15 cm 的小段，枝條剪口以石蠟封固。用75%的酒精對枝條表面進行消毒后再用無菌水沖洗干凈，然后在葡萄枝條中部進行刺傷處理，使用打孔器在葡萄灰霉病菌、葡萄白腐病菌和葡萄潰瘍病菌的PDA 平板上打取菌餅，將其接種于枝條刺傷部位，以空白菌餅為對照，用保鮮膜包扎好，然后進行保濕培養，培養第7 天將發病枝條置于劑量分別為40、100、600 Gy的60Co-γ 射線下輻照，以不作輻照的為對照，每個處理各輻照10個枝條，繼續培養5 d 后記錄病斑直徑，計算病斑面積。

1.2.4 輻照處理對葡萄果實病原真菌的抑制作用的觀測

選取成熟度一致、大小均勻、無病蟲危害的葡萄果實，經75%的酒精消毒后再用無菌水沖洗干凈。使用滅菌接種針在果實表面等距離地扎3個小孔，再用移液槍吸取濃度為105個/mL 的葡萄灰霉病菌和葡萄白腐病菌的孢子懸浮液接種在傷口上[21]，每種孢子懸浮液各20 μL，于25 ℃的溫度條件下培養20 h，待病菌萌發侵入后才進行60Co-γ輻照，其劑量分別設為100、600、1 000 Gy，以接種病菌但未進行60Co-γ 輻照的果實為對照，每個處理各用果實10個，重復3 次。輻照后仍然將其放在25 ℃的培養箱中繼續培養，觀察并記錄各處理下果實的發病情況。

1.3 統計方法

使用Microsoft Excel（Office 2010）軟件整理原始數據、繪制表格；使用SPSS 21.0 軟件進行數據統計與分析。

2 結果與分析

2.1 輻照處理對葡萄3 種病原真菌的影響

2.1.1 輻照處理對病原真菌孢子萌發的影響

不同劑量的60Co-γ 輻照處理對病原真菌孢子萌發的影響情況如圖1所示。由圖1 可知，當輻照劑量大于600 Gy 時，3 種病原真菌孢子的萌發均受到顯著的抑制；其中，60Co-γ 輻照處理對葡萄灰霉病菌的孢子具有明顯的致死作用。以劑量分別為40 和100 Gy 的60Co-γ 輻照處理后，葡萄灰霉病病菌孢子的萌發率與對照處理的無顯著性差異；劑量為600 Gy 的輻照處理可抑制葡萄灰霉病菌94.0% 的孢子的萌發；以劑量在1 000 Gy 及以上的輻照處理后，葡萄灰霉病病菌孢子萌發率最低，僅為0.7%。

圖1 不同劑量的60Co-γ 輻照處理對葡萄3 種病原真菌孢子萌發的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of 60Co-γ radiation at different doses on spore germination of three grape pathogenic fungi

以低劑量（40 和100 Gy）的60Co-γ 射線輻照葡萄白腐病菌和葡萄潰瘍病病菌孢子懸浮液后，其孢子萌發率與對照處理的均無顯著性差異；當輻照劑量高于600 Gy 時，此兩種病菌孢子的萌發率均開始顯著下降；在劑量為2 000 Gy 的輻照處理下，葡萄白腐病菌孢子的萌發率最低（僅為1.9%），其抑制率高達97.4%，而葡萄潰瘍病病菌孢子的萌發率也是最低（為5.9%）的，其抑制率為92.5%。

2.1.2 輻照處理對病原真菌菌絲生長的影響

不同劑量的60Co-γ 輻照處理對3 種病原真菌菌絲生長的影響情況見表1。表1 表明，不同劑量的60Co-γ 輻照處理對不同病菌生長的抑制作用有所不同，低劑量（40 Gy）的輻照處理對葡萄灰霉病菌、葡萄白腐病菌和葡萄潰瘍病菌的菌絲均有一定的刺激與促進生長的作用，當劑量達到一定強度時，60Co-γ 輻照處理對病菌菌絲的生長才有抑制作用。其中，葡萄潰瘍病菌對60Co-γ 的輻照處理最敏感，劑量為100 Gy 的60Co-γ 輻照處理對其就有顯著的抑制作用，而劑量在1 000 Gy 以上的60Co-γ 輻照處理對葡萄灰霉病菌絲才有抑制作用，劑量為2 000 Gy 的60Co-γ 輻照處理可使得葡萄灰霉病菌、葡萄潰瘍病病菌都不能生長，葡萄灰霉病菌菌絲體由白色變成黃褐色，接種至新的培養基上其不能繼續生長，該劑量對葡萄白腐病菌菌絲有顯著的抑制作用，卻沒有殺滅的效果。

表1 不同劑量的60Co-γ 輻照處理對3 種病原真菌菌絲生長的影響?Table 1 Inhibition effects of different doses of 60Co-γ on mycelial growth of three fungal pathogens

2.2 輻照處理對嫩枝扦插成活率的影響

不同劑量的60Co-γ 輻照處理對葡萄嫩枝扦插成活率的影響情況如圖2所示。由圖2 可知，不同劑量的60Co-γ 輻照處理的葡萄枝條成活率不同。隨著輻照劑量的加大，其成活率先上升后降低，當輻照劑量為100 Gy 時，葡萄枝條的成活率達到了最大值，為48.9%；劑量為600 Gy 的輻照處理對枝條成活有一定的抑制作用，但該處理的成活率與對照處理的無顯著性差異。

圖2 不同劑量的60Co-γ 輻照處理對葡萄嫩枝扦插成活率的影響Fig.2 Survival rates of grape cuttings after 60Co-γ radiation at different doses

2.3 輻照處理對葡萄嫩枝真菌病害的抑制效果

對發病嫩枝進行不同劑量的60Co-γ 輻照處理后統計其病斑擴展面積，結果如圖3所示。由圖3A 可知，低劑量（40 Gy）的輻照處理對葡萄灰霉病病斑擴展的抑制作用不明顯，劑量分別為100和600 Gy 的60Co-γ 輻照處理下葡萄灰霉病病斑的擴展面積與對照處理的相比均有顯著性差異；葡萄白腐病病斑擴展面積與輻照劑量呈負相關關系，即隨著輻照劑量的加大病斑擴展面積逐漸減小，劑量分別為100 和600 Gy 的60Co-γ 輻照處理對葡萄白腐病病斑擴展均有顯著的抑制作用，而低劑量（40 Gy）的輻照處理對其抑制作用不明顯（圖3B）；由圖3C 可知，劑量為40 Gy 及以上的輻照處理對葡萄潰瘍病病斑的抑制效果均顯著。

圖3 不同劑量的60Co-γ 輻照對葡萄嫩枝病斑擴展的抑制效果Fig.3 Inhibitory effects of 60Co-γ radiation at different doses on lesion expansion of grape cuttings

2.4 輻照處理對葡萄果實真菌病害的抑制作用

不同劑量的60Co-γ 輻照處理對葡萄果實真菌病害的影響情況如圖4所示。由圖4A 可知，輻照處理2 d 后，各處理組果實的葡萄灰霉病發病率均顯著低于對照處理的，其中，劑量分別為600 與1 000 Gy 的輻照處理的效果均較好，果實的葡萄灰霉病發病率分別僅有10.0%和3.3%；輻照處理4 和6 d 后，劑量分別為600 與1 000 Gy 的輻照處理組果實的葡萄灰霉病發病率均顯著低于對照組的，以劑量為100 Gy 的輻照處理6 d 后果實的葡萄灰霉病發病率與對照組的無顯著差異；輻照處理8 d 后，果實的葡萄灰霉病發病率持續增加，劑量為600 Gy 的輻照處理果實的葡萄灰霉病發病率與對照組的無顯著差異；輻照處理10 d 后，雖然1 000 Gy的輻照處理組與對照組之間仍有顯著差異，但葡萄果實幾乎全部發病。因此，60Co-γ 輻照處理果實只能使葡萄灰霉病的發生時間延后4 ～6 d，仍不能完全控制葡萄果實灰霉病的發生。

由圖4B 可知，劑量為100 Gy 的輻照處理對葡萄果實白腐病的抑制效果不明顯，葡萄果實白腐病的發病率雖略低于對照組的，但其差異沒有達到顯著水平；劑量分別為600 與1 000 Gy 的輻照處理組果實的葡萄白腐病發病率，輻照處理2 d后的均顯著低于對照組的，而輻照處理4 d 后的發病率與對照組的無顯著差異，其中劑量為1 000 Gy的輻照處理對葡萄果實的白腐病的抑制效果最好，輻照處理2 d 后白腐病的發病率為60.0%。因此，一旦葡萄白腐病菌大量侵入傷口，60Co-γ 輻照處理也不能有效阻止病菌在葡萄果實組織中擴展，但可以推遲葡萄果實白腐病在貯藏期間的發病時間。

圖4 不同劑量的60Co-γ 輻照對葡萄果實病原真菌的抑制效果Fig.4 Inhibition effects on fungal pathogens of grape after 60Co-γ radiation at different doses

3 討論與結論

60Co-γ 輻照處理對葡萄3 種真菌病害病原菌的孢子和菌絲都有明顯的抑制甚至致死作用。輻照其孢子時，劑量大于600 Gy 的輻照處理開始有明顯的抑制效果，并且隨著輻照劑量的加大其對孢子萌發的抑制效果越明顯；當輻照劑量為2 000 Gy時，3 種病菌的孢子幾乎都未萌發。輻照其菌絲體時，對60Co-γ 輻照處理的敏感性，菌絲比孢子低；2 000 Gy 的輻照劑量可以阻止葡萄灰霉病菌和葡萄潰瘍病菌的生長，該劑量對葡萄白腐病菌的菌絲雖有顯著的抑制作用，卻沒有殺滅的效果，對葡萄白腐病菌菌絲的抑制可能需要更大劑量的60Co-γ 輻照。

在以60Co-γ 輻照處理抑制葡萄嫩枝3 種真菌病害的試驗中發現，最佳輻照劑量為600 Gy。經60Co-γ 輻照處理后，葡萄嫩枝上3 種病害病斑的擴展面積均小于對照組的，不同劑量的60Co-γ 輻照處理對葡萄灰霉病、葡萄白腐病和葡萄潰瘍病這3 種病菌的病斑在葡萄嫩枝上的擴展均有一定的抑制作用，而且隨著輻照劑量的加大，病斑的擴展面積顯著減小，其中劑量在100 Gy 以上的輻照處理對3 種病菌的抑制作用均顯著，而以劑量為600 Gy的60Co-γ 輻照處理后病斑擴展的面積最小，說明其抑制效果最好，劑量為600 Gy 的輻照處理對葡萄灰霉病、葡萄白腐病、葡萄潰瘍病的抑制率分別為84.5%、75.9%、76.9%，與對照組的相比，劑量為600 Gy 的輻照處理對葡萄嫩枝的成活率無影響。因此建議，嫩枝扦插繁殖時宜采用劑量為600 Gy 的60Co-γ 輻照處理以替代傳統的化學藥劑殺菌方式，從而減少化學藥劑的使用量。

通過在葡萄果實上刺傷接種葡萄灰霉病菌和葡萄白腐病菌，模擬在運輸過程中有擠壓裂果的情況下病菌對果實的侵染狀況，經過60Co-γ 輻照處理后，在處理前期輻照能明顯地抑制葡萄灰霉病和葡萄白腐病的發生，表明60Co-γ 輻照處理可使葡萄果實在貯藏期間病害發生的時間推遲，從而達到延長葡萄果實貨架期的目的。Witbooi 等[19]的研究結果表明，當劑量在900 Gy 及以下時，輻照處理對葡萄品質不會產生不良影響。但是，目前國內尚未有關于60Co-γ 輻照處理對巨峰葡萄品質影響的研究報道，因此，采用劑量為600 Gy 的輻照處理是否能真正預防葡萄果實貯藏期病害的發生，對此尚待進一步研究。

60Co-γ 射線能量大，其滅菌效果比采用蒸汽滅菌等普通滅菌方法的滅菌效果更好，其滅菌更徹底。目前，有關60Co-γ 輻照葡萄枝條的研究主要集中在探討其誘變及性狀變異等方面，有關60Co-γ輻照處理對枝條萌芽率、物候期及新梢生長的影響的研究也有報道，而有關60Co-γ 輻照處理對其病害抑制作用的研究卻鮮見報道[22]。同時，葡萄保鮮技術中的冷藏和氣調保鮮也都有抑制采后病原菌的作用，這些技術各具特點，也都有局限性，只有配合使用輻照保鮮技術與其他保鮮技術，才可產生良好作用，降低輻照劑量，減少輻照成本，提高保鮮效果，促進水果輻照保鮮技術的商業化應用[23-24]。

本研究結果表明，以劑量為600 Gy 的60Co-γ輻照葡萄嫩枝，能顯著抑制其病斑的擴展，且對其嫩枝扦插成活率也無明顯的不良影響。此劑量亦能有效抑制其枝條上攜帶的病菌孢子的萌發和菌絲的生長。60Co-γ 輻照葡萄果實的適宜劑量為600 Gy，此劑量的輻照處理可使葡萄果實貯藏期病害發生的時間推遲4 ～6 d。但是，目前該輻照技術仍局限于實驗室的研究中，還沒有大面積地應用到生產中，而且，60Co-γ 輻照處理對巨峰葡萄品質的影響情況尚不清楚，因此，今后仍需在此劑量的基礎上進行深入的研究，最終達到在不影響植株正常生長和果實品質的前提下最大限度地抑制甚至殺死病原真菌的目的。