蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的形成機(jī)制及其功能性變化研究進(jìn)展

趙鉅陽，袁惠萍，孫昕萌

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)旅游烹飪學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

多酚類物質(zhì)是廣泛存在于食物中的一類重要的植物化學(xué)物質(zhì)[1]，目前相關(guān)研究已表明這些多酚類物質(zhì)在多種疾病中具有較強(qiáng)的抗氧化[2]以及抑菌[3]、抗衰老[4]等功效。在食品體系中，多酚可與蛋白質(zhì)通過可逆和不可逆的方式發(fā)生相互作用形成復(fù)合物，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能和生物利用度等[5-6]。相互作用方式影響蛋白質(zhì)與多酚結(jié)合程度，另外，不同的反應(yīng)條件下多酚與蛋白的結(jié)合程度也受到一定的影響，因此由于蛋白質(zhì)與多酚種類、二者反應(yīng)條件不同，均會(huì)影響多酚與蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合程度，二者形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)也不同，進(jìn)而導(dǎo)致復(fù)合物的功能性以及營(yíng)養(yǎng)學(xué)等方面性質(zhì)發(fā)生改變[7-8]。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)影響功能性（溶解性、乳化性、凝膠性等），利用其功能性可拓寬蛋白質(zhì)的應(yīng)用范圍，因此為更好地了解蛋白質(zhì)與多酚的相互作用，拓寬其應(yīng)用，學(xué)者需借助研究方法更為清晰的了解互作機(jī)理，研究二者之間功能性等變化。

近些年來，已有較多學(xué)者研究蛋白質(zhì)與多酚相互作用機(jī)制[9]，已經(jīng)明確二者之間的相互作用方式，但未能形象地總結(jié)二者的研究方法[10]，研究蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的功能及營(yíng)養(yǎng)學(xué)特性等方面的綜述也不系統(tǒng)。基于此，本文綜述了近年來有關(guān)于蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物形成機(jī)制，介紹了可逆和不可逆的兩種相互作用方式，及其對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特性、食品感官及營(yíng)養(yǎng)學(xué)特性等方面影響的研究進(jìn)展，以期為未來蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的發(fā)展提供參考意見。

1 蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的形成機(jī)制

蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的作用類型主要是可逆和不可逆相互作用作用[11]，其中可逆相互作用主要指非共價(jià)相互作用，其復(fù)合物主要以自組裝的形式形成，目前此方面國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究較多；不可逆相互作用主要指共價(jià)相互作用，其復(fù)合物主要在加熱、堿性或酶催化條件下形成，針對(duì)此方面研究相對(duì)較少[12]。

1.1 可逆相互作用

可逆相互作用指的是非共價(jià)相互作用，包括氫鍵、疏水相互作用、范德華力和離子相互作用[13]。目前研究主要集中在可逆相互作用，這主要是由于缺乏合適的方法來測(cè)定復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。一般來說，蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的形成主要依賴于氫鍵（圖1a）和疏水相互作用（圖1b），其次是其他相互作用（如離子鍵）（圖1c）。針對(duì)可逆相互作用方面學(xué)者已經(jīng)進(jìn)行了關(guān)于多酚與唾液蛋白、牛血清白蛋白、β-乳球蛋白、卵清蛋白、溶菌酶、乳鐵蛋白和酪蛋白等方面的研究[14]。

圖1 蛋白質(zhì)和多酚的非共價(jià)相互作用位點(diǎn)[15]Fig.1 Non-covalent interaction sites of protein and polyphenol[15]

1.2 不可逆相互作用

不可逆相互作用指的是共價(jià)相互作用[16]，共價(jià)相互作用制造蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的常用方法的原理如圖2 所示。堿性反應(yīng)是多酚和蛋白質(zhì)結(jié)合常用的非酶方法之一，多酚在堿性（pH9.0）及有氧的條件下被氧化形成半醌，然后再重排成醌。這些中間產(chǎn)物易與蛋白質(zhì)側(cè)鏈中的親核殘基（蛋氨酸、賴氨酸、色氨酸和半胱氨酸）反應(yīng)，可以形成蛋白質(zhì)和多酚之間的共價(jià)交聯(lián)（C–N 或C–S）[17]（圖2a）。Gu 等[18]發(fā)現(xiàn)自由基誘導(dǎo)產(chǎn)生的共軛物比堿性方法形成的共軛物具有更高的抗氧化活性。此外，反應(yīng)可在室溫下進(jìn)行，不會(huì)產(chǎn)生有毒產(chǎn)物或分解抗氧化劑[19]。因此，該方法被認(rèn)為是制備具有生物活性高的蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的有效合成方法。

酶法是一種環(huán)境友好、特異性高的方法，其合成的復(fù)合物具有較強(qiáng)的自由基清除活性。然而，所用的制備和程序復(fù)雜且昂貴[18]。首先酚酶誘導(dǎo)多酚氧化成鄰二酚，隨后，在氧氣條件下，鄰二酚酶（漆酶）將鄰二酚轉(zhuǎn)化為鄰醌[17]（圖2b），活性醌可與蛋白質(zhì)鏈中的親核氨基酸殘基相互作用形成交聯(lián)蛋白質(zhì)或聚合物。

圖2 蛋白質(zhì)和多酚的共價(jià)相互作用機(jī)理[15]Fig.2 Covalent interaction mechanism of protein and polyphenol[15]

對(duì)于非酶法，采用自由基接枝（圖2c）、抗壞血酸和過氧化氫，非酶法簡(jiǎn)單快捷，應(yīng)用廣泛。首先，位于蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的氨基酸被自由基氧化，然后自由基通過共價(jià)鍵與多酚反應(yīng)，形成較強(qiáng)的相互作用以及高穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物。

2 蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能性的影響

2.1 蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響

多酚的加入會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，從而引起蛋白質(zhì)功能性發(fā)生變化[20-22]。蛋白質(zhì)的一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)由于多酚而發(fā)生變化，其中二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋的含量減少，向無規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)變，蛋白質(zhì)較不穩(wěn)定。Li 等[23]研究水稻蛋白與花青素的相互作用，SDS-PAGE 結(jié)果表明，花青素不會(huì)影響蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，但水稻蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變?chǔ)?折疊含量的增加和其它結(jié)構(gòu)（α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲）的減少以及酰胺Ⅱ帶的光譜位移。皮俊翔等[24]研究茶多酚對(duì)面筋中的面筋蛋白的影響，研究結(jié)果表明茶多酚使面筋蛋白游離氨基和自由巰基的含量增加，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)向無序化轉(zhuǎn)化，并同時(shí)使蛋白質(zhì)中色氨酸殘基逐漸暴露。Chen 等[25]研究發(fā)現(xiàn)pH 可使乳清分離蛋白中游離巰基含量降低和二硫鍵含量增加，α-螺旋和β-折疊含量減少，而β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲含量增加。Chen 等[26]研究發(fā)現(xiàn)預(yù)熱處理的花青素-3-O-葡萄糖苷的結(jié)合使大豆分離蛋白（SPI）的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，α-螺旋和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)減少，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角增加，能顯著提高花青素-3-O-葡萄糖苷的熱穩(wěn)定性和氧化穩(wěn)定性。Jiang 等[27]花青素與SPI 共價(jià)結(jié)合后，α-螺旋和β-折疊的含量減少，從而改變了SPI 的二級(jí)結(jié)構(gòu)，且由于多肽鏈的展開，SPI 的三級(jí)結(jié)構(gòu)也受到了影響。

2.2 蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物對(duì)蛋白質(zhì)功能性的影響

蛋白質(zhì)和多酚之間的相互作用影響蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)[28]，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)的表面疏水性，從而增強(qiáng)蛋白質(zhì)的親水性。蛋白質(zhì)親水/疏水平衡的變化可能會(huì)影響蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的溶解性，進(jìn)而影響其他重要功能特性。目前對(duì)于蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物對(duì)蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)造成影響的研究主要集中在蛋白質(zhì)的起泡性、溶解性、凝膠性、乳化性等。影響蛋白質(zhì)與多酚相互作用的主要因素有兩個(gè)，包括外在（pH 和溫度[29]）和內(nèi)在（多酚和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和類型[30]）因素。

2.2.1 溶解性 蛋白質(zhì)溶解度是確定蛋白質(zhì)在不同食品體系中的各種功能的一個(gè)重要性質(zhì)[31]，蛋白質(zhì)與多酚的結(jié)合對(duì)蛋白的溶解性具有兩面性。一方面研究表明多酚的加入會(huì)提高蛋白質(zhì)的溶解性，例如，乳清分離蛋白和酪蛋白與綠原酸非共價(jià)作用后，蛋白質(zhì)溶解度可增加[32]。Hasni 等[33]研究茶多酚與酪蛋白之間的相互影響，結(jié)果表明茶多酚與蛋白質(zhì)之間的相互作用力是氫鍵、疏水鍵，二者發(fā)生交聯(lián)作用，改變蛋白質(zhì)的電荷，提高溶解性。另一方面，多酚的加入會(huì)降低蛋白質(zhì)的溶解性。Prigent 等[32]研究發(fā)現(xiàn)添加原花青素后，在pH4.0～6.0 范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶解度降低，其原因是帶電荷的多酚類物質(zhì)的附著可能會(huì)改變蛋白質(zhì)的電性，特別是當(dāng)pH 在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近時(shí)，可能會(huì)改變蛋白質(zhì)的溶解度曲線。除此之外，若結(jié)合的多酚為非極性時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性增加，致使其溶解性降低。非極性多酚類物質(zhì)的結(jié)合增加了蛋白質(zhì)的表面疏水性，這不僅可以增加其表面活性，還可以降低其溶解性。多酚和蛋白質(zhì)之間的反應(yīng)可能促進(jìn)蛋白質(zhì)的交聯(lián)，這也可能降低其溶解性。但是二者復(fù)合后會(huì)促使多酚的溶解性提高，因此可以通過蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合作為多酚輸送載體。Chen 等[34]研究姜黃素與未加熱和加熱（75～95 ℃）大豆蛋白的絡(luò)合，與在水中的游離姜黃素相比，姜黃素的溶解性在水中的絡(luò)合度超過98000 倍。

2.2.2 乳化性 為了穩(wěn)定食品乳狀液，通常在食品體系中加入乳化劑以保證乳狀液的穩(wěn)定性[35]。蛋白質(zhì)與多酚的復(fù)合是修飾蛋白質(zhì)功能的有效途徑，合成具有優(yōu)良乳化性能的蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物。目前已有大量研究表明多酚的加入可提高蛋白質(zhì)的乳化性和乳化穩(wěn)定性。江連洲等[36]研究熱處理的SPI 與花青素相互作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)花青素的加入可提高SPI 乳化性、乳液穩(wěn)定性等性能。Anwika 等[37]研究SPI-茶多酚復(fù)合物顯著提高SPI 的乳化能力，可達(dá)43%，乳化穩(wěn)定性可達(dá)59%。以綠茶多酚提取物添加量0.75%制備的SPI-茶多酚復(fù)合物具有較好的乳化性能。不同的多酚類型對(duì)蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物乳化性也有差異，Liu 等[38]采用自由基接枝法合成了乳鐵蛋白-多酚（EGCG、綠原酸和沒食子酸）復(fù)合物，其乳化性能優(yōu)于未改性的乳鐵蛋白，與乳鐵蛋白-EGCG 復(fù)合物和乳鐵蛋白-沒食子酸復(fù)合物相比，乳鐵蛋白綠原酸復(fù)合物顯示出更高的乳化性能。

2.2.3 凝膠性 多酚能與蛋白質(zhì)相互作用形成蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物，產(chǎn)生具有改進(jìn)性質(zhì)的凝膠。一般來說，蛋白質(zhì)的氧化不可避免地發(fā)生在肉制品中，與加工過程中天然肉肌肉的破壞有關(guān)[39]。當(dāng)多酚類物質(zhì)被加入肉制品，蛋白質(zhì)被氧化，隨后產(chǎn)生醌。因此，氨基酸基團(tuán)和醌的反應(yīng)導(dǎo)致凝膠性能增強(qiáng)，從而形成彈性凝膠網(wǎng)絡(luò)。蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的凝膠與添加多酚的量具有一定的影響。Cao 等[40]研究了不同濃度的沒食子酸對(duì)氧化肌原纖維蛋白質(zhì)凝膠特性的影響，當(dāng)沒食子酸濃度分別為6 和30 μmol/g 時(shí)，肌原纖維蛋白質(zhì)的膠凝勢(shì)提高了近50%，這與蛋白質(zhì)的展開及二硫鍵的形成有關(guān)。然而，當(dāng)沒食子酸濃度為150 μmol/g 時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)肌原纖維蛋白質(zhì)的聚集，形成不溶性聚合物，導(dǎo)致凝膠結(jié)構(gòu)變差。李立敏等[41]研究表明，添加適量的茶多酚能顯著改善羊肉肌原纖維蛋白的凝膠性能，凝膠的微觀結(jié)構(gòu)致密、間隙小、形狀規(guī)則、分布均勻。

2.2.4 其他性質(zhì) 多酚會(huì)影響蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的起泡性等性質(zhì)。Sui 等[42]研究不同濃度的花青素對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明花青素提高了大豆分離蛋白的乳化和發(fā)泡性能。岳鑫[43]研究發(fā)現(xiàn)紅松種鱗多酚提高了乳清蛋白的起泡性，當(dāng)紅松種鱗多酚添加量為0.8%時(shí)，乳清蛋白的起泡性達(dá)到最佳，并且紅松種鱗多酚增強(qiáng)了乳清蛋白的持油性和持水性。此外，蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的形成可提高蛋白的抗氧化能力，如Xiang 等[44]研究發(fā)現(xiàn)與游離態(tài)的姜黃素相比，在1%和8%的蛋白質(zhì)含量下，SPI、經(jīng)谷氨酰胺酶處理的大豆蛋白及其與姜黃素的復(fù)合物均表現(xiàn)出顯著的DPPH 自由基清除活性，這可能是由于游離形式的姜黃素在水中溶解度和穩(wěn)定性較差。蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的形成有助于進(jìn)一步提高多酚的抗腫瘤能力，如陳飛平[45]研究發(fā)現(xiàn)大豆蛋白-姜黃素復(fù)合物可提高姜黃素對(duì)HepG2 細(xì)胞的增殖抑制活性。

3 蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物對(duì)營(yíng)養(yǎng)學(xué)特性及食品感官特性的影響

3.1 蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物對(duì)蛋白和多酚營(yíng)養(yǎng)學(xué)特性影響

蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)學(xué)特性主要包含其人體胃腸道消化性的變化和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)估。其中食源蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值取決于其蛋白質(zhì)來源、氨基酸組成、必需氨基酸的比例、加工條件等因素[46]。目前已有相關(guān)研究表明蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的形成影響蛋白質(zhì)的消化特性及營(yíng)養(yǎng)學(xué)特性[47]，例如多酚-蛋白質(zhì)共價(jià)復(fù)合物的形成會(huì)改變蛋白質(zhì)的氨基酸分布，蛋白質(zhì)與水解酶的相互作用會(huì)干擾蛋白質(zhì)在體內(nèi)的消化與吸收。牛奶蛋白質(zhì)與咖啡酸在加熱過程中發(fā)生相互作用，形成復(fù)合物，導(dǎo)致牛奶營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低，表現(xiàn)為可用賴氨酸和硫醇基團(tuán)的數(shù)量減少，這與咖啡酸氧化導(dǎo)致醌產(chǎn)生以及隨后與氨基酸形成絡(luò)合物有關(guān)[48]。高粱中主要高粱蛋白（高粱醇溶蛋白）與單寧發(fā)生相互作用，形成復(fù)合物，導(dǎo)致高粱蛋白質(zhì)消化率降低[49]。

另一方面，蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物不僅可影響蛋白的營(yíng)養(yǎng)學(xué)特性，也會(huì)顯著影響多酚的營(yíng)養(yǎng)學(xué)特性，這主要表現(xiàn)為多酚生物利用度的提高。Kadam 等[50]模擬體外模擬胃腸消化，結(jié)果表明復(fù)合后姜黃素的生物利用率由67%提高到95%。Francisco 等[51]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素負(fù)載的玉米醇溶蛋白納米顆粒在胃腸消化過程中較為穩(wěn)定，提高了槲皮素的生物利用度。Jing 等[52]研究茶多酚-蛋清蛋白復(fù)合物對(duì)蛋清蛋白消化率的影響，發(fā)現(xiàn)茶多酚-蛋清蛋白復(fù)合物顯著提高了消化率，其原因可能是復(fù)合物松散表面結(jié)構(gòu)為消化酶提供了更多的反應(yīng)位點(diǎn)。Liu 等[53]研究發(fā)現(xiàn)，與游離的白藜蘆醇相比，α-乳清蛋白、殼聚糖和白藜蘆醇三者間復(fù)合物的生物可利用度明顯提高50%以上。

3.2 蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物對(duì)食品感官的影響

多酚與蛋白質(zhì)的共價(jià)作用會(huì)引起食品體系混濁、顏色、風(fēng)味等的變化，多酚和蛋白質(zhì)的共價(jià)作用會(huì)使體系的濁度降低。蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物可引起食品體系渾濁，例如油菜籽蛋白產(chǎn)品的顏色變暗和不良風(fēng)味的出現(xiàn)與其中多酚和蛋白質(zhì)的作用也有密切的關(guān)系。

蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物可影響食品體系的顏色，其顏色主要依賴于多酚以及蛋白質(zhì)與多酚相互作用。曾亮等[54]研究發(fā)現(xiàn)，兒茶素在貯藏期間能顯著改變鴨胸肉的白度、紅度和黃度，對(duì)肉的白度和黃度有較好的影響，對(duì)肉的紅度有負(fù)面影響。劉芝君等[55]研究發(fā)現(xiàn)，添加茶多酚能抑制脂肪氧化變質(zhì)，能使臘肉保持較好的顏色。

蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物可影響食品體系的風(fēng)味。生活中比較常見的澀味和植物多酚的存在有著密不可分的關(guān)系[56]。澀味是與食用富含酚類化合物的食品和飲料（例如茶、可可、葡萄酒和精選水果）有關(guān)的風(fēng)味之一[57]。酚類化合物和唾液淀粉酶之間的相互作用導(dǎo)致澀味，用蛋白對(duì)葡萄酒進(jìn)行細(xì)化以減輕其澀味是一種常見的釀酒工藝。葡萄酒的顏色變化與形成更穩(wěn)定的色素（例如吡喃花色素、白藜蘆醇四聚體和葡萄花青素的衍生物）有關(guān)。微氧化處理包括紅酒與氧氣的接觸，穩(wěn)定顏色并改善風(fēng)味和香味，影響酚類化合物結(jié)構(gòu)，從而改變澀味[58]。除了澀味外，還可影響食品體系的其他風(fēng)味。梁慧等[59]研究了茶多酚對(duì)雞氧化性脂肪誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)變性的影響，結(jié)果表明，茶多酚能抑制雞肉氧化脂肪的降解，延長(zhǎng)雞肉的貨架期。

4 蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物形成機(jī)制的常見研究方法

多酚和蛋白質(zhì)的結(jié)合方法可通過計(jì)算結(jié)合常數(shù)來確定力的類型，分析結(jié)合前后蛋白質(zhì)構(gòu)象變化。除紫外可見吸收光譜、熒光光譜、傅立葉紅外光譜等常規(guī)方法外，分子對(duì)接、圓二色譜、拉曼光譜、核磁共振、等溫滴定量熱法等新方法逐漸被用來分析多酚與蛋白質(zhì)的相互作用機(jī)理。

4.1 分子對(duì)接

分子對(duì)接是利用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行處理的技術(shù)，通過分子對(duì)接可以得到多酚與蛋白質(zhì)相互作用的最佳結(jié)合自由能、結(jié)合位點(diǎn)和作用力類型，對(duì)結(jié)合位置和結(jié)合親和力能更準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)，可大大減少昂貴的實(shí)驗(yàn)工作[60]。胡淼等[61]通過分子對(duì)接的方法模擬了矢車菊素-3-葡萄糖苷分別與11S 蛋白、7S 蛋白的最優(yōu)結(jié)合構(gòu)象，它們之間存在較強(qiáng)疏水作用力的同時(shí)，部分結(jié)構(gòu)之間也形成了氫鍵，有助于復(fù)合體系的形成（圖3）。范金波等[62]利用熒光光譜法結(jié)合分子對(duì)接探究咖啡酸與牛血清白蛋白相互作用機(jī)制，分子對(duì)接結(jié)果表明兩者結(jié)合的主要驅(qū)動(dòng)力為氫鍵、靜電相互作用和疏水相互作用，結(jié)合位點(diǎn)為位點(diǎn)I。Fu 等[63]采用分子對(duì)接研究了酸性和中性pH 環(huán)境下花青素-3-O-葡萄糖苷與卵清蛋白的相互作用，結(jié)果表明，二者間的作用力主要是氫鍵和范德華力。

圖3 11S 蛋白（a）、7S 蛋白（b）與矢車菊素-3-葡萄糖苷的對(duì)接結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)圖[61]Fig.3 docking structure of 11S protein（a）and 7S protein（b）with cyanidin-3-glucoside[61]

4.2 圓二色譜

蛋白質(zhì)的遠(yuǎn)紫外圓二色譜反映了蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的特征，可用來分析α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角等構(gòu)象含量，因此通過圓二色譜可分析蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物近紫外圓二光譜（>250 nm）酪氨酸和色氨酸等殘基微環(huán)境，進(jìn)而判斷蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[64]。多酚與蛋白質(zhì)復(fù)合后，最常見的表現(xiàn)是其α-螺旋含量減少，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的增加，這說明多酚的加入會(huì)促使蛋白結(jié)構(gòu)展開，向不穩(wěn)定、不規(guī)則的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。朱穎等[65]利用圓二色譜研究發(fā)現(xiàn)了大豆蛋白和花青素非共價(jià)相互作用后，其α-螺旋相對(duì)含量減少，β-折疊相對(duì)含量上升的現(xiàn)象。Chen 等[66]利用圓二色譜研究表明，pH 顯著增加了負(fù)峰的強(qiáng)度，并引起了峰波長(zhǎng)的藍(lán)移，β-折疊和α-螺旋向β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)變。徐潔瓊[67]利用圓二色譜研究熱處理下β-乳球蛋白及與茶多酚復(fù)合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量，發(fā)現(xiàn)β-轉(zhuǎn)角和α-螺旋向β-折疊和無規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)變。

4.3 拉曼光譜

拉曼光譜可以得到蛋白質(zhì)側(cè)鏈的微環(huán)境以及多肽鏈骨架構(gòu)型的信息[68]。雖然拉曼光譜結(jié)果反映的是蛋白質(zhì)二、三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，但是多酚與蛋白質(zhì)復(fù)合后，其拉曼光譜結(jié)果較為復(fù)雜，并未有較為統(tǒng)一的規(guī)律，這可能是由于不同來源的蛋白質(zhì)與多酚微環(huán)境復(fù)雜，會(huì)影響光譜信噪比。例如Bhattacharya 等[69]利用拉曼光譜研究發(fā)現(xiàn)，EGCG 結(jié)合后蛋白質(zhì)的螺旋含量隨著無序結(jié)構(gòu)的增加而減少。然而謝鳳英等[70]得到的拉曼光譜結(jié)果正相反，其研究蕎麥多酚與米糠蛋白復(fù)合后可通過破壞二硫鍵提高米糠蛋白的穩(wěn)定性。此外，由于拉曼光譜主要集中于蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，因此若體系里多酚含量較大時(shí)，其特征峰幾乎未見。如Liu 等[71]對(duì)利用拉曼光譜分析負(fù)載白黎蘆醇和姜黃素的納米顆粒，并未觀察到多酚官能團(tuán)特征峰。

4.4 熒光光譜

熒光光譜可通過內(nèi)源性熒光光譜圖中熒光強(qiáng)度的變化分析蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物酪氨酸和色氨酸等殘基微環(huán)境，還可通過Stern-Volmer 方程分析獲得酚類化合物與蛋白質(zhì)親和性的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合力類型，進(jìn)而探究多酚-蛋白的結(jié)合機(jī)制。此外，同步熒光光譜通過設(shè)置改變激發(fā)波長(zhǎng)分別獲得色氨酸和酪氨酸的微環(huán)境變化；三維熒光光譜既可通過峰a 獲得酪氨酸和色氨酸殘基的微環(huán)境，又可通過峰b 獲得蛋白質(zhì)多肽鏈的骨架結(jié)構(gòu)變化。Li 等[72]利用內(nèi)源性熒光光譜研究發(fā)現(xiàn)疏水鍵和氫鍵是水稻蛋白-花青素復(fù)合物形成的主導(dǎo)力，并且二者之間是靜態(tài)淬滅。江連洲等[36]通過內(nèi)源性和三維熒光光譜研究發(fā)現(xiàn)花青素與熱處理的SPI 的熒光淬滅機(jī)制為靜態(tài)淬滅，色氨酸和酪氨酸的微環(huán)境發(fā)生改變。操強(qiáng)等[73]利用內(nèi)源性、同步和三維熒光光譜研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇使卵白蛋白氨基酸微環(huán)境發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，其淬滅為動(dòng)態(tài)淬滅，作用力為氫鍵和范德華力。

4.5 核磁共振

核磁共振主要用于確定分子的結(jié)構(gòu)，可監(jiān)測(cè)到蛋白質(zhì)信號(hào)的化學(xué)位移變化，目前核磁共振和分子模型的結(jié)合也被成功地用于在分子水平上理解蛋白質(zhì)與多酚復(fù)合物結(jié)合過程。Silva 等[74]利用核磁共振技術(shù)研究唾液蛋白與食物單寧的分子相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單寧-蛋白質(zhì)的主要驅(qū)動(dòng)力是疏水鍵。Eaton等[75]利用核磁共振測(cè)定了EGCG 對(duì)人血清白蛋白的親和力，結(jié)果表明幾乎所有的EGCG 都是在血液中與白蛋白結(jié)合運(yùn)輸?shù)模@也解釋了EGCG 在體內(nèi)的廣泛組織分布和化學(xué)穩(wěn)定性。Faurie 等[76]利用核磁共振測(cè)定唾液肽、多酚和多糖之間的解離常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，得到化學(xué)位移的變化、核磁共振波峰面積的變化和形成復(fù)合物的大小。

4.6 等溫滴定量熱法

等溫滴定量熱法研究多酚-蛋白質(zhì)相互作用的主要優(yōu)點(diǎn)是可獲得每個(gè)樣品產(chǎn)生的有關(guān)焓、熵、親和力、比熱容和化學(xué)計(jì)量的信息，進(jìn)而通過多酚-蛋白質(zhì)結(jié)合常數(shù)、相互作用類型等洞悉二者復(fù)合機(jī)制[77]。王穎等[78]利用ITC 研究射干苷與5 種蛋白的相互作用，得到反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量比、結(jié)合常數(shù)焓變和熵等熱力學(xué)參數(shù)，結(jié)果表明射干苷與5 種蛋白（除胰蛋白酶外）發(fā)生了相互作用，生成復(fù)合物。Pattanayak 等[79]利用ITC 研究鞣花酸與人血清蛋白相互作用，兩者相互作用是自發(fā)進(jìn)行的，主要作用力是疏水作用和氫鍵。Kilmister 等[80]采用等溫滴定法研究了原花青素低聚物與牛血清白蛋白的結(jié)合，原花青素低聚物的分子量影響其與牛血清白蛋白的結(jié)合，焓變和結(jié)合常數(shù)隨著低聚物尺寸的增大而增大。

5 結(jié)論與展望

蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物可以通過共價(jià)和非共價(jià)相互作用形成，制備具有高生物活性的蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的常見方法是自由基接枝法。蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的形成受環(huán)境條件（溫度和pH）以及蛋白質(zhì)和多酚的類型或結(jié)構(gòu)的強(qiáng)烈影響，因而其表現(xiàn)出抗氧化活性和乳化性能也不同，實(shí)際應(yīng)用時(shí)，可通過控制相互作用的多酚、蛋白質(zhì)種類、比例及環(huán)境條件，調(diào)控并開發(fā)出具有良好營(yíng)養(yǎng)、功能、感官和生物活性更好的新型食品配料產(chǎn)品。雖然目前此方面的研究較多，但由于多酚與蛋白質(zhì)種類繁多，加上反應(yīng)條件不盡相同，因此蛋白質(zhì)影響酚類的確切機(jī)制與規(guī)律尚不明確統(tǒng)一。雖然酚類化合物的強(qiáng)化可以改善健康食品的特性，但在不同加工處理下，酚類化合物與食品成分（尤其是蛋白質(zhì)）的相互作用可能會(huì)對(duì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)、抗氧化效率和蛋白質(zhì)消化率產(chǎn)生較大的負(fù)面影響。因此，未來需要對(duì)不同基質(zhì)和不同加工條件下的蛋白質(zhì)-多酚相互作用進(jìn)行更深入的研究，以指導(dǎo)開發(fā)富含營(yíng)養(yǎng)和健康益處的富含酚類功能性蛋白食品。