降糖肽的制備、生物學效應及其構效關系研究進展

張廷新，李富強，張 楠，朱麗萍，顏世敢

（齊魯工業大學（山東省科學院）生物工程學院，山東省微生物工程重點實驗室，山東濟南 250353）

糖尿病是因胰島素分泌不足引起的以高血糖為特征的慢性代謝病[1]。持續性高血糖會引發多種并發癥，如糖尿病性腎病、糖尿病性眼病、糖尿病性心血管病、糖尿病性腦血管病、糖尿病性神經系統病變和糖尿病足等，嚴重者危及生命。隨著肥胖人群增加，糖尿病的發病率逐年上升。2019 年全球糖尿病患者達4.63 億。預計到2030 年全球糖尿病患將達5.78 億。糖尿病已造成嚴重的社會和經濟負擔[2]。

糖尿病患者需長期服用降糖藥物。目前市場上的降糖藥包括胰島素類注射制劑和口服降糖藥物。口服降糖藥物以化學藥為主，該類藥物主要通過增加胰島素敏感性、延緩碳水化合物在小腸的代謝來修復改善胰島β細胞功能及促進其分泌胰島素，但多數具有一定的副作用（表1）[3]。因此，研發安全、有效的降糖藥物成為熱點。

表1 常用降糖藥物的類型及其作用機制和副作用Table 1 Types of commonly used hypoglycemic drugs and their mechanisms of action and side effects

降糖肽具有活性好、結構簡單、穩定性高、吸收好、免疫原性低、副作用少等優點。降糖肽分為內源性降糖肽和外源性降糖肽兩類。內源性降糖肽存在于細胞內，主要通過促進糖原、脂肪、蛋白質合成，促進胰島素分泌和抑制胰高血糖素分泌等途徑來降低血糖，如胰島素、GLP-1、GIP 等；外源性降糖肽主要來自于豆類、海藻、堅果等外部食物蛋白質。外源性降糖肽一般含有2～15 個氨基酸殘基，常以無活性的前體形式存在于蛋白中，需要通過酶解、模擬胃腸消化、微生物發酵等方法將多肽從前體蛋白中釋放出來。制備降糖肽的常用方法包括酶水解、微生物發酵和化學合成等。目前多數研究，是從天然蛋白中分離、鑒定多肽，然后對多肽進行化學合成，得到純度更高的肽組分，以便進行后續的表征。用于酶水解的常見酶包括酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶等。微生物發酵作為降糖肽的一種制備方法，枯草芽孢桿菌、米曲霉和植物乳桿菌是常用的微生物。水解處理后進行肽的分離、結構鑒定和表征。常用的分離技術包括超濾、凝膠過濾、反相高效液相色（RP-HPLC）等。對于降糖肽的活性表征，通常使用IC50或抑制率來衡量其降糖活性。

降糖肽的活性主要取決于其氨基酸序列。降糖肽通常含有疏水性氨基酸（如亮氨酸、脯氨酸）及堿性氨基酸（如精氨酸）等。本文結合降血糖活性評價方法綜述了近年來降糖肽的制備純化、結構鑒定及降血糖活性的體外和體內證據，探討了降糖肽結構與其降血糖活性之間的關系，以期為抗糖尿病相關功能性食品、保健品及藥物的開發應用提供參考。

1 降糖肽的制備

酶解是將降糖肽從前體蛋白中釋放出來的常用方法。目前已通過酶解動植物蛋白制備多種降糖肽，其中從豆類中鑒定的降糖肽最多。

酶解法制備降糖肽時，需首先提取蛋白質。蛋白質的種類繁多，性質差別大，提取方法不同。食品工業中廣泛采用pH-Shift 法分離蛋白質[4]。Chen 等[5]使用pH-Shift 法從田納西大豆中提取大豆蛋白。Hatanaka 等[6]在使用Umamizyme G 和Bioprase SP 酶解脫脂米糠前，采用pH-Shift 法提取米糠蛋白。

緊密的細胞結構會阻礙酶與蛋白的結合，導致酶的敏感性降低。蛋白能與細胞中的某些成分（如脂類）結合，從而阻礙蛋白質的提取。另外，降糖肽的高度疏水性，使其不易溶于水，不利于后續的分離純化。采用微波[7]、超聲[8]等輔助技術能克服這些問題。Wen 等[8]發現，超聲處理能增強慈菇蛋白對胃蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶的敏感度。超聲處理還能改變蛋白質的二級結構，影響其生物活性。Rivero-Pino 等[9]在酶解黃粉蟲制備降糖肽時發現，超聲處理降低了蛋白中α螺旋和β折疊的含量，增強了蛋白對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。原因可能是超聲處理促進蛋白質暴露其疏水性氨基酸殘基。

另外，在酶解過程中蛋白酶的選擇也極為重要。不同蛋白酶具有不同的限制性切割位點，通過切割不同部位的肽鍵可以產生不同氨基酸組成的活性肽。常用的酶包括堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風味蛋白酶等。有時采用多種蛋白酶聯合使用的方法，例如按照胃蛋白酶-胰蛋白酶的順序來模擬胃腸道消化制備降糖肽。選用不同蛋白酶制備的降糖肽其降糖活性存在較大差異。Hatanaka 等[6]使用Umamizyme G和Bioprase SP 分別酶解米糠蛋白制備的二肽基肽酶IV（DPP-IV）抑制肽對DPP-IV 的IC50分別為2.3、26.4 mg/mL，二者功效相差11 倍以上。Admassu 等[10]使用胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶水解紫菜蛋白，其中胃蛋白酶水解物對α-淀粉酶的抑制率最高，抑制率為50%，中性蛋白酶水解物的抑制率最低，僅為18.27%。

酶解法制備的降糖肽的生物活性不僅取決于酶的類型，還取決于水解度（DH）[11]。Ren 等[12]使用堿性蛋白酶酶解大麻種子蛋白制備的降糖肽，對α-葡萄糖苷酶的抑制活性在一定范圍內隨著水解度的增加而增加，在水解度為27.24%±0.88%時，抑制率最大，為58.26%±3.26%；然而當水解度達33.25%±2.05%時，其抑制活性降低。表明過度水解不利于降糖肽的制備。這可能是由于過度水解導致水解產物中具有降糖活性多肽含量的下降。DH 為20%～40%，對DPP-IV有較大的抑制活性[13]。Li-Chan 等[14]在酶解大西洋鮭魚皮明膠制備DPP-IV 抑制劑時發現，酶底比（E/S）對水解物的抑制活性也有密切關系，同時水解度與酶底比也存在一定的相關性。使用風味蛋白酶酶解鮭魚皮明膠，在E/S 為6%時對DPP-IV 抑制率最大（45.2%）。而且三種酶（堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風味蛋白酶）的水解度與E/S 成正相關。

酶的種類、水解度以及酶底比，都直接或間接地通過改變降糖肽的氨基酸序列和結構來影響其生物活性[12,14]。

2 降糖肽的分離純化與結構鑒定

降糖肽的傳統分離方法主要采用鹽析和萃取，但這兩種方法制備的降糖肽的純度較低，而且復雜的成分會與多肽相互作用，從而影響多肽的生物活性。因此目前多采用膜過濾法和色譜法進行降糖肽的分離純化。盡管近些年在色譜技術上取得了進展，但低選擇性可能仍然是分離大小或性質相似生物分子的技術難題。因此，在一些研究中采用色譜技術和非色譜方法相結合的方法。例如，Yuan 等[15]從苦瓜水解物中分離純化降糖肽，先使用截留分子量10 kDa 的濾膜超濾，然后采用Sephadex G-25 過濾和高效液相色譜法分離純化。還有研究利用等電點和分子量的差異，采用電滲析和超濾相結合的方式分離降糖肽[16]。

從外源性蛋白水解物中分離純化降糖肽通常是以活性測定為導向，輔以色譜和非色譜分離技術，最后通過質譜或Edaman 降解法對純化的肽進行鑒定。鑒定出的肽序列，可采用化學合成多肽，驗證其降血糖活性。除了確定肽的分子量外，還可使用高效液相色譜串聯質譜法來鑒定降糖肽的氨基酸序列[17]。也可利用生物信息學來預測多肽，如利用BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）來比對新肽序列是否存在于前體蛋白的氨基酸序列中，使用 BIOPEP（http://www.uwm.edu.pl/ biochemia）來預測肽序列是否為新肽以及多肽的生物活性，利用PepDraw（https://www.tulane.edu/～biochem/WW/PepDraw/）來預測多肽的理化性質[17]。

另外，在某些肽序列上發現的各種翻譯后修飾的氨基酸殘基可能會給肽鑒定帶來額外挑戰。目前，文獻中鑒定和報道的降糖肽大都是含有未修飾的氨基酸殘基。鑒定由修飾殘基組成的降糖肽可能會是未來的研究熱點。

3 降糖肽的活性評價

3.1 降糖肽的體外活性評價

降糖肽的體外效應通常是通過測定其對二肽基肽酶（DPP-IV 酶）、α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶等參與血糖調節的酶的抑制效應來評估的。

DPP-IV 是一種絲氨酸蛋白酶，通過特異性切割氨基末端2 個氨基酸殘基（Xaa-Pro 和Xaa-Ala）來調節腸促胰島素的生物活性，從而調節體內的葡萄糖代謝[18]。腸促胰島素包括GLP-1（胰高血糖素樣肽1）和GIP（葡萄糖依賴性促胰島素多肽，也稱胃抑肽），是攝取食物后由腸分泌的肽類激素，其主要作用是調節血糖水平，抑制胰腺分泌胰高血糖素[19]。GIP 能夠促進葡萄糖誘導的胰島素分泌，此外還能增強脂肪組織的餐后脂質代謝[20]。GLP-1 除了可以增強葡萄糖誘導的胰島素分泌，還可以抑制胰腺胰高血糖素的分泌，延緩胃排空，抑制食欲和食物攝入[21]。因此，在糖尿病的控制中，可選擇抑制DPP-IV 的生物活性，提高體內GLP-1 和GIP 的含量，從而達到降血糖的目的。目前，已有文獻報道了多種降糖肽在體外均對DPP-IV 有抑制作用（見表2）。Mune 等[22]用堿性蛋白酶和熱裂解酶酶解Bambara 豆蛋白的水解物具有相似的DPP-IV 抑制活性（IC50=1.73 mg/mL），并且具有明顯的DPPH 自由基清除活性和亞鐵螯合活性，對氧化應激具有保護作用。Nongonierma 等[23]從駱駝乳清蛋白水解物中分離出對DPP-IV 具有較強抑制作用的降糖肽VPV、VPI、VPF。其中VPV被認為是目前發現的僅次于IPI 的DPP-IV 抑制肽。

表2 降糖肽的體外生物學效應Table 2 In vitro biological effects of hypoglycemic peptides

α-葡萄糖苷酶是一種糖苷水解酶（EC3.2.1.20），位于腸刷邊緣，具有水解低聚糖中存在的α-1，4-糖苷鍵，然后將其轉化為可從腸道吸收進入血液中單糖的功能。通過抑制α-葡萄糖苷酶的作用，可以延緩食物攝取后碳水化合物的消化，從而減少血液中葡萄糖的整體吸收，防止高血糖[24]。Zhang 等[25]利用定量構效關系（QSAR）篩選法和家蠶多肽數據庫篩選α-葡萄糖苷酶的抑制肽，得到了4 種對α-葡萄糖苷酶有較強抑制作用的多肽：QPGR、SQSPA、QPT、NSPR，其IC50分別為65.8、20、560、205 mol/L。Ren 等[12]從大麻子蛋白中發現2 個新的α-葡萄糖苷酶抑制肽LR 和PLMLP。多肽中的疏水性氨基酸，特別是脯氨酸和亮氨酸對α-葡萄糖苷酶的抑制活性具有重要貢獻。Kang 等[26]從米曲霉發酵物中分離出α-葡萄糖苷酶抑制肽CL 和PFP。

α-淀粉酶（EC3.2.1.1）是一種消化酶，屬于糖基水解酶家族，其基本功能是催化糖原、淀粉（α-1，4-糖苷鍵）等多糖水解成麥芽糖、葡萄糖、麥芽三糖等較低分子量的產物。作為體內消化碳水化合物的主要酶之一，抑制它將促進血糖水平的整體下降[27]。Yu 等[28]從白蛋白中分離出α-淀粉酶抑制肽KLPGF，其IC50為（120±4.0）μmol/L，KLPGF 還具有較強的α-葡萄糖苷酶抑制活性。Siow 等[29]從孜然種子中分離到肽FFRSKLLSDGAAAAKGALLPQYW，具有抑制α-淀粉酶的作用，抑制率為24.54%。通過構效關系研究發現肽的抑制作用可能是由于肽的存在阻礙了碳水化合物底物（如淀粉）與α-淀粉酶的結合，從而抑制了酶的催化作用。

細胞系或細胞模型也常用來進行降糖活性的評估，例如肝癌（HepG2）細胞[30]、腸（Caco-2）細胞[31]、INS-1E（大鼠胰島素瘤細胞模型）[32]、AR42J（大鼠胰腺外分泌細胞）[33]等來研究葡萄糖攝取、模擬胃腸消化和胰島素敏感性等。

體外研究通常采用消化酶的生化分析來評價多肽和水解物的降血糖活性，例如，還有少數采用細胞模型來探究降糖肽對不同類型細胞的影響。但這些都不能很好的反映出多肽或水解物在人體內所發揮的生物學效應。因此，未來研究應注重在體外研究的基礎上進行體內研究。

3.2 降糖肽的體內活性評價

降糖肽的體內效應研究相對較少，大多數研究還停留在蛋白水解物的體內效應而沒有鑒定具體的肽序列（表3）。已報道有來自奶酪的LPQNIPPL 能降低健康大鼠的餐后血糖[39]和從魚皮明膠中分離的GPVGPAGNPGANGLN 能夠增強STZ 糖尿病小鼠的胰島素分泌[40]。體內研究使得對降糖肽和水解物的生物學效應研究成為可能。但有研究者認為，動物試驗結果可能不能直接預測人類對降糖肽的反應[41]。但這些研究提高了我們對降糖肽和蛋白水解物生物學效應的認識。有些效應不容易通過體外研究來探索，例如降糖肽對動物糖耐量[42]和胰腺β細胞的影響[43]等。

表3 降糖肽或水解物在小鼠模型中的效應Table 3 Effects of hypoglycemic peptides or hydrolysates in rats model

降糖肽的體內效應常在糖尿病小鼠模型上進行研究，例如鏈脲佐菌素（STZ）誘導的糖尿病模型、四氧嘧啶（ALX）誘導的糖尿病模型和db/db 小鼠（自發性基因突變小鼠）等。誘發性動物模型中高脂高糖飲食聯合STZ 誘導的動物模型是目前常用的Ⅱ型糖尿病模型[44]。ALX 誘導的糖尿病模型應用相對較少[45]。關于糖尿病動物的造模方法及其優缺點，可參考裴天仙[46]、唐藝丹[47]等的報道。

劉洪霞等[48]研究發現，用沙棘蛋白灌胃處理db/db 糖尿病小鼠，沙棘蛋白可明顯提高糖尿病小鼠的葡萄糖敏感性，減少葡萄糖的吸收，有效降低糖尿病小鼠的血糖。另外，沙棘蛋白還能改善小鼠的精神狀態，減輕糖尿病對小鼠的損傷。有些蛋白水解物不但具有降血糖活性，還能改善血脂譜。Wang 等[49]發現，核桃蛋白水解物（3～10 kDa）不僅能夠使鏈脲佐菌素（STZ）誘導的Ⅱ型糖尿病小鼠的空腹血糖降低64.82%，胰島素分泌增加23.71%，肝臟葡萄糖激酶和糖原水平分別降低69.54%和76.19%，而且還能顯著降低血清中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平。

通過降低四氧嘧啶誘導的糖尿病小鼠（AIDR）的血糖水平，證明章魚蛋白和其蛋白水解物均具有降血糖作用[50]。章魚蛋白水解物比章魚蛋白在降血糖作用上更有效，而且水解物比阿卡波糖降低血漿、腸和胰腺中的α-淀粉酶的活性更高。

通過糖尿病小鼠體內血清、腸道中α-淀粉酶的活性[51]和胰腺細胞中胰島素的表達水平[43]可以證明斑馬魚蛋白水解物和Vglycin 在體內的降血糖作用。α-淀粉酶活性和胰島素水平在降低血糖水平上發揮著重要作用。斑馬魚蛋白的氨基酸組成分析結果表明，亮氨酸含量最豐富，其次是精氨酸和谷氨酸。許多研究報道不同游離氨基酸對2 型糖尿病患者胰島素分泌的影響。亮氨酸是一種促胰島素分泌劑，通過氧化脫羧和變構激活谷氨酸脫氫酶來誘導和增強胰腺β細胞胰島素的分泌[52-53]。精氨酸[53]和苯丙氨酸衍生物[54]均具有調節胰島素分泌的作用。但口服斑馬魚蛋白中亮氨酸和精氨酸的豐度與胰島素水平之間的關系還有待進一步的研究。

某些蛋白水解物在體內不僅具有降血糖作用，還具有其他活性。例如，Kilari 等[55]證實駱駝奶蛋白水解物在STZ 糖尿病小鼠體內不僅具有顯著的降血糖作用，還可明顯增強超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性，降低丙二醛（MDA）含量。使用斑馬魚蛋白水解物處理的AIDR 糖尿病小鼠，體內的SOD、GPX、CAT 等酶的活性增強，斑馬魚蛋白水解物還具有調節ACE 酶的作用[56]。高血壓是糖尿病的主要并發癥，而ACE 酶是體內參與血壓水平調節的重要酶。因此，蛋白水解物的多活性作用對糖尿病管理具有重要意義。但這些蛋白水解物是否真的具有多種生物活性，還是這些活性是由不同的肽發揮的，需要深入研究來證實。

4 降糖肽的構效關系

定量構效關系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）可以評估某種蛋白是否為降糖肽的潛在來源，還可以預測新肽的潛在降糖活性。分子質量、氨基酸組成和疏水性被認為是影響降糖肽活性的關鍵結構特征。

降糖肽的降糖作用取決于其結構。降糖肽通常由2～15 個氨基酸殘基組成，分子量為228～1656 Da（表4）。降糖肽的降血糖活性受鏈長影響。降糖肽的氨基酸殘基數<7（分子量<700～800 Da）時活性最強，氨基酸殘基數為7～25（分子量800～3000 Da）時次之，鏈長更長的活性最低[61]。Valencia 等[62]發現在易煮菜豆、難煮菜豆水解物中，分子量小于3 kDa的超濾組分對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，其次是分子量為3～10 kDa 的組分，分子量大于10 kDa 的組分抑制率最低。

通常小肽更容易被人體吸收，具有更強的降糖活性[63]。Lacroix 等[64]利用Caco-2 細胞來研究乳蛋白肽的生物利用度，在WR、IPI、IPIQY、LPYPY、LKPTPEGDL 等五個肽中，WR 顯示出最高的轉運率。而Ding 等[65]研究發現YFCLT 和GLLLPH 均能進入Caco-2 單層細胞。因此，大于3 個氨基酸殘基的多肽是否會被小腸吸收并不容易預測。

除分子量外，一些特殊氨基酸在降血糖中也發揮著重要作用。報道的許多食品衍生肽的DPPIV 抑制劑N 端多數含有Xaa-Pro（Xaa 表示氨基酸殘基）。Pro 殘基對DPP-IV 的抑制作用具有重要貢獻[66]。如來自蠟樣芽孢桿菌培養物的DPP-IV 抑制肽Diprotin A（Ile-Pro-Ile）and B（Val-Pro-Leu）均具有該結構[67]。Hikida 等[68]發現Trp-Pro 的抑制作用最強。然而，Uenishi 等[39]發現多肽FPGPIPN、VPPFIQPE、YPFPGPIPN 雖然具有Xaa-Pro 結構，但卻無明顯的DPP-IV 抑制作用。盡管Pro 殘基在降血糖方面上具有潛在作用，但顯然還存在其他作用機制，使不含Pro 殘基的降糖肽在體內外也具有降糖作用。從核桃中分離的多肽LVRL 和 LRYL 可顯著提高 IR HepG2 細胞的葡萄糖消耗能力及 GSH-Px和CAT 的活性，且能有效清除細胞內 ROS 含量[30]。肽FEELN、LSVL、LSVSVL 能抑制Caco-2 細胞對葡萄糖的攝取，具有降血糖作用[31]。值得注意的是，LVRL、LRYL、FEELN、LSVL 和LSVSVL 都至少含有一個亮氨酸，亮氨酸和其他疏水氨基酸殘基的存在可能有助于多肽與膜脂雙層的相互作用，促進其進入細胞，從而提高其降血糖活性。表4 中列出了已經得到驗證的降糖肽的疏水性氨基酸殘基在其序列中所占的比例。顯然，疏水性氨基酸殘基的存在并不是多肽降血糖活性的必要條件。

表4 降糖肽的構效關系Table 4 Structure-activity relationship of hypoglycemic peptides

近年來，基于計算機的QSAR 方法已廣泛應用于諸多領域，例如，藥物設計、材料科學、化學等，但在食品科學中應用較少。在降糖肽的篩選中，利用傳統方法需進行大量的實驗。與傳統方法相比，QSAR 方法利用數學建模、分子對接和模擬、化學計量學等在生物活性肽的篩選中顯示出顯著優勢[69]。Wang 等[70]基于空間電場、靜電場、疏水場等構建了三維定量構效關系（3D-QSAR）模型，從60 種多肽中篩選出6 種DPP-IV 抑制肽，分別為VSM、ISW、VSW、ICY、ISD 和ISE。通過體外研究發現均具有明顯DPP-IV 酶抑制活性，其中肽ICY 抑制活性最高，IC50為0.73 mmol/L。

在QSAR 建模中還存在一些問題有待解決。例如，QSAR 方法沒有考慮到數據的異質性。此外，化學結構的構象柔性仍然是一個有待進一步研究的問題。但是，QSAR 方法對生物活性肽領域的研究人員仍然有很大的幫助。近年來，雖然QSAR 已應用于生物活性肽的食品科學研究中，但如何將QSAR 應用于降糖肽中仍需深入研究。

5 結論與展望

根據體內外研究，降糖肽被認為是一種非常具有前景的抗糖尿病類藥物，本文通過對國內外降糖肽的制備、分離純化、結構表征、生物學評價以及構效關系的綜述，揭示了降糖肽的研究空白領域。雖然一些降糖肽的生物學效應已經確定，但還未證明這些肽在食品、保健品、藥品生產中的應用。此外，降糖肽的大規模開發與應用應考慮食品和藥品的加工條件對降糖肽的降血糖活性和生物利用度的影響，以及這類多肽產品的高生產成本、質量、生物活性、有效性和安全性需要進一步的研究。

另外，胃腸道消化對降糖肽的有效性、穩定性和生物利用度的影響還需通過體內實驗進一步確定。未來的研究還應注重降糖肽的腸道吸收機制，以及它們的潛在多功能性。更多的體內研究可以通過口服含有純肽的復雜食藥系統來研究多肽的降血糖活性，而不是口服純多肽。

雖然降糖肽已經顯示出作為藥品的潛力，但到目前為止，只有少數商業化的降糖肽產品。除了體內研究和臨床試驗外，迫切需要研究在食品、藥品加工過程中添加到目標基質中的降糖肽的活性和結構穩定性。此外，多肽結構對降糖肽降血糖機制的影響還缺乏深入的研究，如脈沖電場和圓二色譜，可以幫助推斷肽的二級結構與其降血糖活性之間的潛在聯系。因此，進一步研究降糖肽的構效關系對于降糖肽作用機制具有重要意義，也將拓寬其潛在的應用前景。

綜上所述，在過去的十年里，越來越多的研究表明，降糖肽可以在體外、細胞和動物模型中發揮降血糖作用，在食品、保健品和藥品等方面具有潛在的應用前景，但要為這些應用奠定基礎，未來還需要進行更多深入的研究。