三種傳統發酵食品中酵母菌的分離鑒定與特性分析

田 輝，謝引榮，王 琰，馬 卓，范文廣，趙 萍，曹瑩瑩，任海偉

（蘭州理工大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050）

發酵食品可提高食品的營養和安全性，改善食品感官特性[1]。而酵母菌是許多發酵食品中必不可少的功能性微生物之一，在工業食品生產和傳統發酵食品中都發揮著重要作用[2]。酵母菌作為單細胞真核微生物，長期以來不僅被用于面包和酒精類食品生產中，在其他發酵食品生產中也具有主導作用，如傳統發酵類的植物、乳制品、魚類和肉類[3]。酵母菌主要在食品發酵中起到產生酒精、改善質地、酸化保藏、產生抑菌性物質、提高營養價值、去除抗營養因子以及產生生物活性肽和維生素等作用[4]。

自然界中發現的酵母菌已有1 500多種[5]。傳統發酵食品中酵母種類也很多，且不同食品中的酵母菌種類也有差異，如傳統發酵乳中的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）、庫德畢赤酵母菌（Pichia kudriavzevii）及其他畢赤酵母屬（Pichiaspp.）菌株；發酵肉制品中的漢遜德巴利酵母（Debaryomyce shansenii）、誕沫假絲酵母（Candida zeylanoides）及解脂耶羅威亞酵母（Yarrowia lipolytica）；發酵橄欖、可可和咖啡中的釀酒酵母、仙人掌有孢漢遜酵母（Hanseniaspora opuntiae）、畢赤酵母屬、威克漢姆酵母屬（Wickerhamomycessp.）及假絲酵母屬（Candidaspp.）[3]。除酵母菌的發酵特性及有益作用外，部分酵母菌通過產生水解酶類、形成氣體、分解有機酸、產生色素或異味等，導致食品（以高酸性或高糖度食品為主）腐敗[6]。

我國傳統發酵食品種類豐富、原料多樣、所含菌種資源豐富。微生物的多樣性研究，有助于闡明傳統食品的發酵機制及開發自主產權發酵劑，或有效控制腐敗微生物生長，保障食品安全。紅茶菌、藏靈菇及酸菜作為我國傳統自制發酵食品，其營養特性及所含有的微生物種類逐漸受到人們重視，不同地區和培養環境下，其中的酵母菌種類和特性具有一定差異性，有待深入研究及利用[7-9]。本研究從紅茶菌、藏靈菇及甘肅地區酸菜中分離和鑒定酵母菌，并對菌株發酵性能進行分析，以期為酵母菌資源利用提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

紅茶菌：采集自甘肅省蘭州市和陜西省寶雞市，各1份；藏靈菇：采集自山東省德州市和安徽省蕪湖市，各1份；酸菜：采集自甘肅省永登市2個不同農戶，各1份。

1.1.2 培養基

紅茶菌活化培養基：綠茶2 g，蔗糖15～20 g，蒸餾水500 mL，煮沸15～20 min，于超凈臺中用4層無菌紗布過濾，密封后備用。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）改良培養基：200 g去皮土豆（切塊）煮沸20 min后，過濾冷卻，添加瓊脂粉16 g，蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，氯霉素0.1 g，蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

PDA培養基：200 g去皮馬鈴薯（切塊）煮沸20 min，冷卻后用四層紗布過濾，加葡萄糖20 g，固體培養基加瓊脂粉16 g，蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

亞甲基藍、重鉻酸鉀、無水乙醇、蛋白胨、氯霉素、葡萄糖、蔗糖、乳糖及瓊脂粉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；酵母基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技有限公司；ExTaqDNA聚合酶（5 U/mL）：寶生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；UV2600A型紫外可見分光光度計：尤尼科（上海）儀器有限公司；TGL-16G離心機：上海安亭科學儀器廠；SK200生物顯微鏡：麥克奧迪實業集團有限公司；SHZ-82恒溫振蕩器：常州國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌的分離純化[10]

無菌條件下，吸取不同樣品（或發酵液）25 mL至225 mL生理鹽水（8.5 g/L NaCl）中，充分混勻，并以10倍梯度稀釋法稀釋至10-8，再取100 μL不同梯度的稀釋液涂布于PDA改良培養基（含氯霉素）上，倒置于30 ℃培養箱，培養48 h后觀察菌落形態特征。使用接種環挑取不同形態的菌落，分別劃線于PDA固體培養基，培養48 h后，根據菌落形態進行第二次劃線和培養，得到酵母菌單一純化菌落。

1.3.2 菌種的保藏與活化[11]

挑取單一菌落至PDA 液體培養基中，30 ℃振蕩（200 r/min）培養24 h，連續培養兩代，按酵母菌液∶甘油溶液=3∶2的比例添加滅菌的體積分數50%的甘油溶液，使甘油最終體積分數為20%，混勻后-20 ℃冷凍保藏。

保藏菌種使用前需進行活化，即將菌種接種于PDA液體培養基中，30 ℃振蕩（200 r/min）培養24 h，連續活化兩代。

1.3.3 酵母菌的鑒定

（1）菌株形態學鑒定

觀察純化單一菌落的顏色、形狀、邊緣、表面光滑度及濕潤度等特征。

挑取單一菌落，進行美藍染色，并在光學顯微鏡（40×）物鏡下觀察菌體形態。

（2）糖發酵試驗

分別將PDA液體培養基中的碳源設定為D-葡萄糖、蔗糖及乳糖。采用杜氏管法，將活化三代后菌株以2%的接種量接種至裝有倒置杜氏管的10 mL PDA培養基中，30 ℃培養2～3 d，觀察和記錄菌株對不同碳源的發酵情況。對于不發酵或發酵力較弱的菌株，延長觀察至10 d[12]。

（3）rDNA基因間隔序列（ITS）測定

離心收集菌體，提取基因組，對rDNA-ITS序列進行擴增和測序。正反向引物分別為ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCCG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）。采用50 μL反應體系為：2.5 U ExTaq酶，5 μL 10×ExTaqBuffer（Mg2+），50 μmol 脫氧核糖核苷三磷酸（deoxynucleotide triphosphate，dNTP）Mixture，2 μg模板，5 μmol正反向引物，無菌去離子水補齊至50 μL。反應程序為：94 ℃預變性5 min，35個循環包括：94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 000 bp/min。最后72 ℃延伸10 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送測序公司進行序列測定。所得DNA序列在美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）網站上通過基于局部比對算法的搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）進行比對，初步確定菌株的種屬[13]。并將rDNA-ITS序列提交至GenBank獲取序列注冊號。

使用MEGA 6軟件構建基因發育樹，將目標序列與多個模式菌株的rDNA-ITS，通過鄰接法（neighborhood-joining method，NJ）構建系統發育樹，自展值（bootstrap value）分析設置重復1 000次。

1.3.4 酵母菌的發酵與生長特性

（1）產乙醇試驗

將活化菌株以2%（V/V）的接種量接種于PDA液體培養基中，置于30 ℃發酵3 d，采用重鉻酸鉀比色法測定產乙醇能力[13]。以乙醇含量（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制乙醇含量-吸光度值的標準曲線，得到線性方程為y=23.886x+0.001 6，相關性系數R2=0.996 3。

（2）生長曲線測定

將酵母菌按5%（V/V）的接種量接入PDA液體培養基中，在30 ℃條件下培養，以未接種PDA培養基為對照，每組設置兩個平行，每隔3 h測定培養液在波長600 nm處的OD600nm值，連續測48 h，繪制酵母菌的生長曲線。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離純化

經過3次平板劃線培養，分別從藏靈菇、紅茶菌及酸菜中分離到14株酵母菌疑似菌株（見表1）。

表1 不同食品來源中的酵母菌疑似菌株Table 1 Suspected yeasts from different food sources

2.2 菌株種屬鑒定

2.2.1 菌株形態學特征

觀察14株疑似酵母菌的菌落特征與細胞形態，結果見表2。由表2可知，菌落形態基本上都是圓形，顏色分別呈白色、乳白色或淡黃色，大多菌落表面光滑。細胞形態有圓形、橢圓形、卵圓形或臘腸狀等。根據不同食品來源，其中紅茶菌中的酵母菌菌落較大，而藏靈菇和酸菜中菌落較小。以上特征說明不同來源之間酵母菌具有形態學多樣性。

表2 不同食品來源疑似酵母菌的菌落特征與菌體細胞形態Table 2 Colony characteristics and cell morphology of suspected yeasts from different food sources

2.2.2 糖發酵試驗

由表3可知，大部分疑似菌株（X1-1、X1-2、X3-3、Y4-2、R5-1、R5-2、R5-3、R5-4、M2-1、M2-2）可代謝葡萄糖，而對蔗糖和乳糖發酵性能較弱或不能發酵，如發酵蔗糖時，菌株X1-1和X3-3可較快產氣，而X1-2則需7 d后才產生氣泡；發酵乳糖時，僅X1-1和X3-3表現出可代謝性能。經過形態學特征觀察及糖發酵試驗，發現菌株間存在一定差異，但需配合rDNA-ITS序列測定對其種屬進行更為精確的鑒定。

表3 不同食品來源疑似酵母菌的糖發酵試驗結果Table 3 Sugar fermentation test of suspected yeasts from different food sources

2.2.3 rDNA-ITS序列分析

rDNA-ITS序列經PCR擴增及測序后，通過美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）中BLAST程序進行同源性比對（見表4）。經序列測定和分析，確定了14株疑似酵母菌中有9株為酵母菌，而其他5株的rDNA-ITS序列未能通過PCR擴增得到相應DNA產物，推測其為單細胞原核微生物。將9株菌的rDNAITS提交至GenBank后，獲得序列注冊號分別為：MZ506852（M2-1）、MZ506853（M2-2）、MZ506854（R5-1）、MZ506855（R5-2）、MZ506856（R5-3）、MZ506857（R5-4）、MZ506858（X1-1）、MZ506859（X1-2）及MZ506860（X3-3）。

使用MEGA6軟件構建了目標菌株與參考菌株rDNAITS序列的系統發育樹見圖1。

由表4、圖1可知，9株酵母菌歸為4個不同的屬。其中，藏靈菇發酵乳中分離到的3株菌（X1-1、X1-2、X3-3）鑒定為馬克斯克魯維酵母（Kluyveromy cesmarxianus）；紅茶菌發酵液中獲得的3株菌（R5-2、R5-3、R5-4）鑒定為異常假絲酵母（Candida incommunis）及1株菌鑒定為Starmerella davenportii；酸菜中分離到的2株菌（M2-1、M2-2）鑒定為瑟氏哈薩克斯坦酵母（Kazachstania servazzii）。不同種類食品中菌株屬于不同種類酵母菌。

圖1 基于rDNA-ITS序列不同食品來源篩選酵母菌的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of screened yeasts from different food sources based on rDNA-ITS sequences

表4 基于rDNA-ITS序列菌株對比結果Table 4 Comparison of strains based on rDNA-ITS sequences

2.3 酵母菌發酵特性分析

2.3.1 產乙醇能力

酵母菌屬于兼性厭氧菌，無氧環境下會將葡萄糖分解產生CO2和乙醇。乙醇發酵是評價酵母菌發酵性能的重要指標之一。

由圖2可知，產乙醇量最低的菌株為馬克斯克魯維酵母X3-3（29.6%），產乙醇量較高的為異常假絲酵母R5-2（75.8%）和瑟氏哈薩克斯坦酵母M2-2（71.0%）。相對而言，紅茶菌和酸菜中的酵母菌株產乙醇能力強于藏靈菇中酵母菌，即馬克斯克魯維酵母的產乙醇力較弱，而Starmerella davenportii、異常假絲酵母及瑟氏哈薩克斯坦酵母的產乙醇力較強。

圖2 不同酵母菌產乙醇能力比較Fig.2 Comparison of ethanol production capacity of different strains

2.3.2 生長特性

選取每個種屬中乙醇產量最高的菌株，進行0～51 h生長曲線的測定（見圖3）。由圖3可知，4種酵母菌中馬克斯克魯維酵母生長能力最佳，菌株X1-2在約6 h時即進入對數期，且在約30 h時達到最大菌數（OD600nm值=6.152）。

圖3 四株酵母菌的生長曲線Fig.3 Growth curves of 4 yeast strains

而其他3種酵母在PDA培養基中生長較緩慢，其中瑟氏哈薩克斯坦酵母M2-2在約9 h時進入對數期，約15 h進入穩定期，而此階段OD600nm值＜0.6。異常假絲酵母R5-2在0～39 h期間的菌體增殖較為平緩，但在39～51 h期間增殖較為迅速，并在51 h達到最大吸光度值（OD600nm值=1.313）。Starmerella davenportiiR5-1在0～51 h內增殖最為緩慢，整個階段，OD600nm值＜0.2，可能是PDA培養基中缺少該菌株所需營養物質導致的。

3 討論

3.1 酵母菌的分類學研究

馬克斯克魯維酵母最初曾被歸屬為酵母屬，后來劃歸至克魯維酵母屬[15]。馬克斯克魯維酵母分別被美國和歐洲認定為滿足“公認安全”（generally regarded as safe，GRAS）和“安全資格認定”（qualified presumption of safety，QPS）的安全菌株標準[16]。由圖1可知，馬克斯克魯維酵母與瑟氏哈薩克斯坦酵母在一個進化分支上。瑟氏哈薩克斯坦酵母以前被稱為賽瓦酵母，屬于酵母屬[17]。因此，馬克斯克魯維酵母與瑟氏哈薩克斯坦酵母進化關系較為接近，與本實驗中結果是一致的。Starmerella davenportii與異常假絲酵母在另一個進化分支上。Starmerella davenportii曾被稱為Candida davenportii，后來被重新命名為Starmerella davenportii，可見二者具有較為接近的進化關系[18]。

根據《酵母菌的特征與鑒定手冊》，馬克斯克魯維酵母對葡萄糖、蔗糖和乳糖的發酵性能為可變性；異常假絲酵母不可發酵乳糖，對葡萄糖的發酵至7 d后才出現氣泡，對蔗糖發酵力具有可變性[19]。而本實驗中馬克斯克魯維酵母X1-1和X3-3對3種糖都具有發酵能力；異常假絲酵母R5-2、R5-3及R5-4對葡萄糖的發酵至7 d后觀察到氣泡，對蔗糖和乳糖都不能發酵。在《酵母菌的特征與鑒定手冊》中，賽瓦酵母（瑟氏哈薩克斯坦酵母）可發酵葡萄糖，不可發酵蔗糖和乳糖[19]。哈薩克斯坦酵母屬由于缺乏β-半乳糖苷酶，因此不能利用乳糖[20]。本研究中，瑟氏哈薩克斯坦酵母M2-1與M2-2可發酵葡萄糖，對另兩種糖都未觀察到發酵能力。因此，馬克斯克魯維酵母、異常假絲酵母及瑟氏哈薩克斯坦酵母的糖發酵試驗結果與《酵母菌的特征與鑒定手冊》基本一致。

Starmerella davenportii在《酵母菌的特征與鑒定手冊》中未被收錄。但文獻報道中的益生型酵母Starmerella davenportiiDo18可發酵D-葡萄糖、棉子糖及果糖，不發酵乳糖[18]。本研究中Starmerella davenportiiR5-1對D-葡萄糖的發酵至7 d后產氣，而對蔗糖和乳糖則不能發酵，因此試驗結果與菌株Do18基本一致。

3.2 傳統發酵食品中的酵母菌

藏靈菇即西藏開菲爾粒，是由乳酸菌、醋酸菌和酵母菌等微生物組成的共生體[21]。盧曼等[22]從藏靈菇中分離出釀酒酵母屬、克魯維酵母屬及亞羅酵母屬中的16株菌，其中8株確定為馬克斯克魯維酵母菌。馬克斯克魯維酵母菌作為一種食品級酵母，具有多種益生特性，如可代謝乳糖和菊粉、較高耐熱性、可產生溶解酶類、較高生長速率及產生乙醇等，因而非常適合工業應用[15]。

紅茶菌即康普茶，是茶糖水經酵母菌、醋酸菌及乳酸菌等微生物發酵而成的一種功能性飲料[23]。紅茶菌中主要有假絲酵母屬、酒香酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬、類酵母屬、接合酵母屬、畢赤酵母屬、德克酵母屬及德巴利酵母屬等[23-24]。近期報道的益生型酵母Starmerella davenportiiDo18也分離自紅茶菌[18]。

酸菜和泡菜是我國傳統發酵蔬菜類食品，含有多種酵母菌和乳酸菌等微生物。烏日娜等[25]從延邊泡菜中分離出4株耐鹽較強的賽瓦酵母。瑟氏哈薩克斯坦酵母（賽瓦酵母）在一些發酵食品中可以起到改善風味的作用[26]。但有研究認為，瑟氏哈薩克斯坦酵母是韓國泡菜中形成不良白色菌膜的主要酵母之一，會導致泡菜產品脹包、形成不良氣味及引起泡菜質地軟化[27]。

馬克斯克魯維酵母相較于其他酵母菌，具有更快的生長速率，這與文獻報道是一致的[15]。在營養豐富培養基中，馬克斯克魯維酵母的生長速率是釀酒酵母的兩倍[28]。馬克斯克魯維酵母同釀酒酵母一樣，屬于兼性厭氧菌，可通過將糖發酵成乙醇產生能量，也可通過氧化磷酸化及三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環產生更多能量[15]。而后者有利于菌體生物量的增加。本研究中馬克斯克魯維酵母產乙醇力較弱，而生長性能優異，因此菌株X1-1、X1-2及X3-3更偏向于將更多碳源通過有氧呼吸產生能量，從而提高了菌體繁殖速率。

4 結論

從3種傳統發酵食品中分離到4個不同種屬中的9株酵母菌，包括藏靈菇中的3株馬克斯克魯維酵母（Kluyveromy cesmarxianus）、紅茶菌中的1株Staemerella dovenpoetii酵母和3株異常假絲酵母（Candida incommunis）及酸菜中的2株瑟氏哈薩克斯坦酵母（Kazachstania servazzii）。不同食品來源的酵母菌種屬及發酵性能各不相同，且菌株之間發酵性能具有顯著差異性。3株馬克斯克魯維酵母產乙醇力較弱，但菌株X1-2生長速率快且活菌數高；異常假絲酵母R5-2和瑟氏哈薩克斯坦酵母M2-2產乙醇能力較強。