西里伯斯青鳉tyr和slc24a5的克隆及表達分析

馬 元 仲 穎 郭 婧 李名友

(1. 上海海洋大學國家海洋生物科學國際聯合研究中心, 上海 201306; 2. 上海海洋大學水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室, 上海 201306)

體表的顏色是脊椎動物的重要表型, 具有物種識別、社會交流、光保護、擇偶和對捕食者的警告和威脅等作用[1,2]。體色的形成和維持需要一系列細胞因子、基因和生理因子的調控[3]。黑色素作為一種生物色素, 在體色形成中發揮重要作用。黑色素由黑色素細胞合成, 黑色素合成途徑非常保守且黑色素生物合成的分子機制已被廣泛研究[4]。體色基因在線網站中(www.espcr.org/micemut/)共記錄了378個體色相關候選基因, 其中171個基因已經被克隆。酪氨酸酶(tyr)[5]、酪氨酸相關蛋白-1(tyrp-1)[6]、溶質載體24家族成員5(slc24a5)[7]、溶質載體7家族成員11 (slc7a11)[8]、黑色素皮質激素受體1(mc1r)[9]和刺鼠蛋白(asip)[10]等體色調控相關基因可誘導不同物種色素模式的突變。

Tyr又稱單酚加氧酶, 廣泛分布于不同的生物體內,tyr是黑色素合成過程中關鍵的限速酶。tyr主要調節黑色素合成的前兩個步驟: 前體酪氨酸在tyr的催化下生成3,4-二羥基苯丙氨酸(多巴,DOPA), 多巴進一步被tyr氧化形成多巴醌(DQ)[11]。多巴醌經過一系列復雜的調控形成真黑色素和褐色色素, 真黑色素產生黑色和棕色表型, 褐色色素產生黃色和紅色表型。研究發現, 體內tyr活性的缺失會導致黑色素產生減弱或消失, 最終導致脊椎動物表現出不同程度的白化表型。在黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)中,tyr在正常和白化黃顙魚組織中的表達水平具有顯著差異[6]。在虹鱒(Oncorhynchus mykiss)中通過Morpholio抑制tyr的表達,在孵化后25d和35d時視網膜和皮膚的色素沉著明顯減少[12]。通過CRISPR/Cas9技術單靶點敲除日本青鳉(Oryzias latipes)tyr基因, 日本青鳉眼部色素明顯缺失[13]。值得注意的是, 當去除tyr啟動子區域的Tol2轉座子后, 白化病表型的日本青鳉轉化為野生型著色的青鳉[5]。此外, 有研究表明, miR-330-5p是tyr強有力的負調控因子, 持續過表達miR-330-5p可導致色素沉著的消失[14]。

Slc24a5是溶質載體24家族的第5個成員, 是人類(Homo sapiens)重要的色素沉著基因,slc24a5在南亞人色素沉著多樣性中起著非常重要的作用[15,16]。Slc24a5基因編碼的蛋白為NCKX5, NCKX5被證實定位在黑色素細胞的線粒體和高爾基體反面網絡結構上, 而不是黑色素細胞的細胞膜上。線粒體中NCKX5的缺失削弱了黑素體中Ca2+的富集, 從而影響了黑素體的成熟和黑色素的產生[17],slc24a5的表達模式與黑素團標記物基因(tyrp2)相似, 均在視網膜色素上皮和黑素團中表達[7]。在黑色綿羊(Ovis aries)的皮膚中slc24a5的相對表達量是白色綿羊的20.53倍[18]。在雞(Gallus gallus domesticus)中,siRNA被證明可以有效抑制slc24a5的表達,slc24a5表達的減少導致黑色素合成也相應減少[19]。魚類上, 在金色斑馬魚(Danio rerio)中首次克隆研究了slc24a5, 并證明了slc24a5在色素沉著中起重要作用, 金色斑馬魚與野生型斑馬魚相比, 黑色素沉著明顯延遲和減少, 將野生型的全長slc24a5轉錄本注射到純合金色斑馬魚胚胎中, 黑色素沉著可在一定程度上恢復[20]。

西里伯斯青鳉(Oryzias celebensis)是青鳉屬的一種淡水魚, 原產于印度尼西亞蘇拉威西島, 很可能在蘇拉威西島孤立的生活了超過2900萬年[21]。西里伯斯青鳉具有生長周期短、胚胎透明、繁殖快、雌雄表型差異顯著等優點。在本研究中, 我們克隆了西里伯斯青鳉黑色素合成相關基因Octyr和Ocslc24a5, 通過熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測了這兩個基因在不同組織和不同胚胎發育時期的表達,整體原位雜交(WISH)分析了這兩個基因在胚胎中的時空表達。本研究從分子生物學水平為解析tyr和slc24a5在西里伯斯青鳉黑色素沉積中的作用奠定基礎, 為西里伯斯青鳉體色研究提供重要資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所用的野生型西里伯斯青鳉飼養在上海海洋大學青鳉魚房的循環水養殖系統中, 溫度維持在28—29℃, pH維持在6.8—7.0, 保持14h的光照和10h黑暗的光周期。成年雌性西里伯斯青鳉每天可產約30枚卵, 胚胎發育階段根據文獻所述確定[22]。

1.2 西里伯斯青鳉tyr和slc24a5 cDNA的克隆

我們利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Ensembl(https://asia.ensembl.org/index.html)在線網站收集并整理其他物種tyr和slc24a5基因的序列信息。通過對其他物種核酸和氨基酸序列的比對,在保守區域設計了這兩個基因的簡并引物(表 1)。PCR擴增得到Octyr和Ocslc24a5 cDNA的部分序列,然后根據得到的cDNA部分序列設計基因特異性引物(表 1)。使用SMART?RACEs試劑盒(Clontech)合成5′-RACE和3′-RACE的 cDNA第一條鏈, 用合成的第一條鏈為模板, 通過PCR擴增得到兩端的序列。將RACEs擴增到的片段和普通PCR得到的cDNA部分片段進行組裝, 然后利用NCBI提供的BLAST工具確定組裝序列是否正確。在正確序列的5′和3′端設計引物, 合成全長cDNA進行PCR驗證。PCR產物經1%或2%瓊脂糖凝膠電泳確定大小, 利用膠回收試劑盒(TaKaRa)對正確的片段進行回收。然后將回收產物連接到pGEM-T Easy載體(Promega)中, 再轉化到感受態大腸桿菌DH5α菌株中。最后將陽性菌株送往上海邁普生物有限公司進行測序。

1.3 西里伯斯青鳉tyr和slc24a5基因組DNA的克隆

采用飽和Nacl法提取基因組DNA。剪取西里伯斯青鳉尾巴置于1.5 mL EP管中, 在管中加入STE緩沖液(10 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)、1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、0.1 mmol/L氯化鈉(NaCl)、pH 8.0)、10%十二烷基硫酸鈉(SDS)和蛋白酶K, 56℃水浴鍋中消化過夜。將飽和NaCl加入上述管中, 輕輕搖勻, 加入氯仿混勻, 離心。取上清, 并在上清中加入異丙醇沉淀基因組DNA,用75%的酒精洗滌兩次。將基因組DNA溶解于1/1000 RNase溶液中, 置于–40℃供進一步分析使用。我們通過在線網站Ensembl搜索并整理了小鼠、人類、斑馬魚和青鳉的基因組序列, 根據已公布的其他物種基因組序列和獲得的CDS(Coding sequence)序列, 設計引物擴增tyr和slc24a5基因組DNA序列(表 1)。

表1 tyr 和 slc24a5 基因克隆和表達所用引物序列Tab. 1 Primers for cloning and expression analysis of tyr and slc24a5

1.4 序列分析

使用DNAMAN和Vector NTI對tyr和slc24a5的氨基酸序列進行多重比對, 利用在線網站SignalP 5.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行信號肽預測, 利用在線網站TMHMM2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)對蛋白的跨膜區域進行預測, 利用ProtParam工具(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)進行相對分子質量、等電點PI的預測, NetNGlyc1.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/Net NGlyc)預測N端糖基化位點。此外, 利用Mega 7.0軟件采用相鄰接法構建系統發育樹。

1.5 熒光定量PCR

利用TRIzol法提取西里伯斯青鳉不同胚胎發育時期(2-細胞期、囊胚期、原腸胚、神經胚、3d、7d和剛孵出的小魚)和8個成年組織(腦、眼、腸、腎、肝、皮膚、卵巢和精巢)的總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000檢測提取到的總RNA的質量。每個發育階段的胚胎各收集45顆, 每15顆作為一個重復。對三雌三雄成年西里伯斯青鳉進行組織取樣, 每條魚的相同組織作為一個重復。按照反轉錄試劑盒(TaKaRa)說明進行反轉錄合成cDNA。β-actin作為內參基因, 與Octyr、Ocslc24a5進行平行擴增。qRT-PCR在Bio-Rad CFX Manager熒光定量PCR儀上進行。反應體系為SYBR Premix ExTaq(2×)10 μL, 正向和反向引物各1 μL, cDNA 2 μL, ddH2O 定容至20 μL。反應程序為: 95℃ 30s, 95℃ 5s, 56℃ 20s, 72℃ 15s, 共40個循環。程序結束后進行熔解曲線分析, 若溶解曲線呈現單峰則定量準確, 并進行分析。對每個樣本進行三次擴增, 并做三個樣本重復。每對引物設置一個陰性對照(用ddH2O代替模板)。所有引物均是使用Primer6.0軟件設計(表 1)。使用2–ΔΔCt方法計算基因的相對表達量, 利用GraphPad 5.0軟件進行作圖。

1.6 整體原位雜交

利用整體原位雜交檢測Octyr和Ocslc24a5mRNA在不同胚胎發育時期的時空定位[23]。利用全長CDS引物(Octyr-cDNA-F & R和Ocslc24a5-cDNA-F & R)擴增Octyr和Ocslc24a5的CDS序列,將得到的正確片段連接到T-easy載體中, 分別命名為ptOctyr和ptOcslc24a5。使用XbaⅠ或XhoⅠ酶切質粒使質粒線性化, 然后使用地高辛(DIG)標記試劑盒(Roche)將線性化的質粒反轉錄合成正義和反義探針。因為日本青鳉黑色素最早出現在第22階段(8—9個體節期)的卵黃囊上[22], 所以當胚胎發育到第20階段或更早期時我們使用0.25 mmol/L苯基硫脲(PTU)處理胚胎以抑制胚胎中黑色素沉積。整體原位雜交具體步驟如文獻[24]所述。每隔1—1.5h在顯微鏡下觀察胚胎顏色, 倒置體視鏡(Nikon,SMZ25)進行拍照。

2 結果

2.1 Octyr和Ocslc24a5的克隆和序列分析

Octyr全長cDNA 2249 bp, 包含126 bp 5′非編碼區、488 bp 3′非編碼區和1635 bp編碼區, 編碼545個氨基酸(GenBank登錄號: MW199762)。Oc-Tyr蛋白的預測分子量為61.9 kD, 等電點為6.17。用SignalP 5.0在線網站在Octyr的N端預測到18個氨基酸殘基的信號肽。在Octyr氨基酸序列的C端預測到位于474—496 aa的跨膜結構域。在Octyr氨基酸序列中包含兩個銅離子結合位點, CuA和 CuB,與其他脊椎動物相比該結構高度保守。同時, 我們通過對OcTyr與其他脊椎動物的Tyr進行多重氨基酸比對, 共發現14個保守的半胱氨酸殘基。六個假定N-糖基化位點也相對保守。

Ocslc24a5的全長cDNA序列包含160 bp 5′ 非編碼區、363 bp 3′ 非編碼區以及1542 bp的編碼區,該編碼區編碼一個含有514個氨基酸殘基, 3′ 非編碼區中具有典型的AATAAA聚腺苷酸化信號, 提示該cDNA包含了Ocslc24a5的完整編碼序列(Gen-Bank登錄號: MW199763)。OcSlc24a5預測分子量為56.6 kD, 等電點為5.29。OcSlc24a5氨基酸序列包含12個跨膜區域, 分別位于15—37、79—98、122—144、151—173、183—202、207—226、319—336、349—371、381—403、416—438 、451—473和 180—502 aa。

2.2 OcTyr和OcSlc24a5氨基酸序列比對及系統進化樹分析

將OcTyr氨基酸序列與日本青鳉(O. latipes)、斑馬擬麗魚(Maylandia zebra)、羅非魚(Oreochromis niloticus)、鯉(Cyprinus carpio)、斑馬魚(D.rerio)、小鼠(Mus musculus)、人類(H.sapiens)的Tyr氨基酸序列進行比對。結果顯示, 在比對的這8個物種中, OcTyr與日本青鳉的同源性最高為93.7% 。與斑馬擬麗魚和羅非魚的同源性次之, 均為79.7%, 與鯉的同源性為63.7%, 與斑馬魚的同源性為61.7%。與小鼠和人類的同源性依次為57.5%和56.2%。將OcSlc24a5氨基酸序列和其他脊椎動物的Slc24a5氨基酸序列進行比對, OcSlc24a5與魚類中的日本青鳉(O. latipes)、羅非魚(O. niloticus)、眼斑雙鋸魚(Amphiprion ocellaris)和貝氏隆頭魚(Labrus bergylta)、斑馬魚(D. rerio)有著較高同源性, 分別為97.2%、91.1%、90.8%、85.8%和82.8%, 與小鼠(M. musculus)和人類(H. sapien)的同源性較低均為69.5%。

系統發育樹顯示, OcTyr和日本青鳉(O. latipes)Tyr聚成一個小分支, 與其他魚類聚成一個大分支,這與預期的一致(圖 1)。此外, 兩棲類、鳥類和哺乳動物的Tyr聚在另一個大分支。同時, 根據構建的系統發育樹, 我們發現OcSlc24a5與羅非魚(O.niloticus)、眼斑雙鋸魚(A. ocellaris)、玻璃魚(Parambassis ranga)和日本青鳉(O. latipes)親緣關系較為親近, 聚在一個小分支上, 與貝氏隆頭魚(L. bergylta)、齒鯡(Denticeps clupeodies)和斑馬魚(D. rerio)聚為一個大分支。最后兩棲類、鳥類和哺乳動物的Slc24a5聚在另一個大分支(圖 1)。這些結果表明, OcTyr和OcSlc24a5的氨基酸序列在進化上是保守的。

圖1 Tyr和Slc24a5氨基酸序列系統進化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of Tyr and Slc24a5 amino acid sequences

2.3 Octyr和Ocslc24a5基因組DNA序列結構分析

通過PCR克隆并拼接得到Octyr和Ocslc24a5的基因組DNA序列。拼接得到6.3 kb的Octyr基因組序列(GenBank登錄號: MW240440), 開放閱讀框跨越5個外顯子, 與斑馬魚、人和小鼠的外顯子數量相同。斑馬魚、人類和小鼠的tyr基因組長度是Oc-tyr基因組長度的3.2—18.9倍(圖 2)。Ocslc24a5的基因組長度為6.08 kb(GenBank登錄號: MW200252)。值得注意的是, 通過比較研究斑馬魚、人類和小鼠的基因組DNA結構, 我們發現Ocslc24a5的基因組有8個外顯子和7個內含子, 而斑馬魚、人類和小鼠有9個外顯子和8個內含子。斑馬魚、小鼠和人類的基因組長度分別是西里伯斯青鳉slc24a5基因的2.5倍、3.5倍和3.7倍(圖 2)。

圖2 Octyr和Ocslc24a5基因組結構分析Fig. 2 Genomic organization of Octyr and Ocslc24a5

2.4 Octyr和Ocslc24a5在成體組織和不同胚胎發育時期均有分布

采用qRT-PCR檢測了Octyr和Ocslc24a5在不同組織中的相對表達水平。結果顯示,Octyr和Ocslc24a5在腦、眼、腎、肝、腸、皮膚、卵巢和精巢等組織中均有表達(圖 3A和圖 3B)。在檢測的8個組織中,Octyr在精巢中表達量最高, 其次是眼睛、腦和皮膚, 在腸中表達量最低,Octyr在精巢中表達量是眼睛的6倍, 大腦的17倍;Ocslc24a5在精巢、腦和眼睛高表達, 其中在精巢中表達量最高,且卵巢中的表達量大于皮膚中的表達量, 精巢中的Ocslc24a5表達量大約是眼睛的2倍, 腦的8倍, 腸的1300倍。

同樣, 采用qRT-PCR檢測了Octyr和Ocslc24a5在西里伯斯青鳉不同胚胎發育時期(2-細胞期、囊胚期、原腸胚、神經胚、3d、7d和剛孵出的小魚)的相對表達水平。孵化前,Octyr和Ocslc24a5的表達均隨著胚胎的發育逐漸增加; 孵化后, 基因表達水平均降低。Octyr在神經胚表達水平最低,Ocslc24a5在囊胚期表達水平最低。當胚胎發育到第7天時, 兩個基因的表達均達到最高(圖 3C和圖 3D)。

圖3 Octyr和Ocslc24a5在不同組織和不同胚胎發育時期的相對表達水平Fig. 3 The relative expression of Octyr and Ocslc24a5 in different tissues and different embryo stagesA—B. 西里伯斯青鳉不同組織中Ocslc24a5和Octyr的相對表達水平; C—D. 西里伯斯青鳉不同胚胎發育時期Octyr和Ocslc24a5的相對表達水平A—B. Real-time fluorescent quantitative PCR analysis of Octyr and Ocslc24a5 in different tissues of O. celebensis. C—D. Realtime fluorescent quantitative PCR analysis of Octyr and Ocslc24a5 in different embryo stages of O. celebensis

2.5 Octyr和Ocsl24a5 在胚胎中的時空表達

為了研究Octyr和Ocslc24a5在胚胎發育過程中的時空表達, 我們進行了整體原位雜交實驗。結果顯示,Octyr和Ocslc24a5的時空表達模式非常相似。在囊胚期的所有細胞中均檢測到了Octyr和Ocslc24a5信號(圖 4A和圖 5A)。在神經胚和6體節期, 我們發現Octyr和Ocslc24a5在背部和卵黃膜上表達(圖 4B和4C和圖 5B和5C)。在24體節期和體節完成期, 這2個基因的信號在眼睛、中腦、間腦、后腦和側背皮膚中都被檢測到(圖 4D和4E、圖 5D和5E)。Octyr和Ocslc24a5的表達域逐漸從背部向全身擴散, 且表達水平隨著發育而升高。在體節完成期使用正義探針作為陰性對照, 結果顯示,正義探針未檢測到信號(圖 4F和圖 5F)。

圖4 Octyr在胚胎中的時空表達Fig. 4 Spatial and temporal expression of Octyr during embryogenesisA. 11期, 囊胚晚期; B. 17期, 神經胚早期; C. 21期, 6體節期; D. 27期, 24體節期; E. 32期, 體節完成期; F. 32期, 陰性對照; ey. 眼睛; di.間腦; mb. 中腦; hb. 后腦; sc. 脊髓; tb. 尾芽A. Stage 11, late blastula stage; B. Stage 17, early neurula stage; C. Stage 21, 6 somite stage; D. Stage 27, 24 somite stage; E. Stage 32,somite completion stage; F. Stage 32, negative control; ey. eye; di. diencephalon; mb. midbrain; hb. hindbrain; sc. spinal cord; tb. tail bud

圖5 Ocslc24a5在胚胎中的時空表達Fig. 5 Spatial and temporal expression of Ocslc24a5 during embryogenesisA. 11期, 囊胚晚期; B. 17期, 神經胚早期; C. 21期, 6體節期; D. 27期, 24體節期; E. 32階, 體節完成期; F. 32期, 陰性對照; ey. 眼睛; di.間腦; mb. 中腦; hb. 后腦; sc. 脊髓; tb. 尾芽A. Stage 11, late blastula stage; B. Stage 17, early neurula stage; C. Stage 21, 6 somite stage; D. Stage 27, 24 somite stage; E. Stage 32,somite completion stage; F. Stage 32, negative control; ey. eye; di. diencephalon; mb. midbrain; hb. hindbrain; sc. spinal cord; tb. tail bud

3 討論

3.1 Octyr和Ocslc24a5生物信息學分析

黑色素在動物體內分布廣泛, 是體色形成和維持的重要因素之一。許多研究表明,tyr和slc24a5在脊椎動物黑色素的合成中起著至關重要的作用。Octyr的序列長度、蛋白分子量、等電點等與其他脊椎動物, 如小鼠[25]、人[26]和雞[27]相近。此外, 我們預測到Octyr有7個保守功能結構域, 這與其他脊椎動物的tyr蛋白功能結構域一致[6,28]。例如, 兩個銅離子結合區域、位于N端的信號肽和五個糖基化位點等。有研究表明, 少于兩個N-糖基化位點的tyr突變體不與鈣合蛋白相互作用,tyr酶活性完全消失[29]。位于N端的信號肽由18個氨基酸組成, 負責將新合成的肽鏈運輸到內質網進行加工。經過糖基化和內質網處理, 序列最終被運輸到黑素小體[30]。兩個保守的銅離子結合位點(CuA和CuB)含有6個保守的組氨酸殘基, 它們在tyr的催化活性中發揮重要作用[31]。Ocslc24a5編碼514個氨基酸, 包含12個跨膜區域, 這些區域具有氨基酸轉運的功能[32]。此外, 多重氨基酸序列比對和系統發育樹分析顯示,Octyr和Ocslc24a5的氨基酸序列在進化關系上與日本青鳉最為接近。因此, 我們推測Octyr和Ocslc24a5基因的功能可能與日本青鳉相似。Octyr的開放閱讀框有5個外顯子, 與小鼠、人類和斑馬魚的外顯子相同。值得注意的是, 我們發現Ocslc24a5基因組有8個外顯子, 而小鼠、人類和斑馬魚基因組有9個外顯子。綜上,Octyr和Ocslc24a5在進化上是保守的。

3.2 Octyr和Ocslc24a5的組織和不同胚胎發育時期表達分析

tyr和slc24a5在成體組織和胚胎中的分布已在不同物種中得到廣泛研究[33,34]。在本研究中,Octyr在檢測的所有成體組織中均有表達, 其中精巢中表達水平最高。然而, 在一些脊椎動物中,tyr基因在某些成體組織中不表達, 如文昌魚的精巢和腸道[35],及泥鰍的腹肌和心臟[36]中均未檢測到tyr。在哺乳動物中, 不同毛色的山羊tyr表達水平不同, 深灰色山羊tyr的相對表達量是淺灰色個體的19.29倍[37]。類似的,Ocslc24a5在所有檢測的成體組織中均有表達, 在眼睛、大腦和精巢中高表達, 與雞[33]和斑馬魚[38]相似。此外,Octyr和Ocslc24a5基因在西里伯斯青鳉的腎和肝中表達, 腎和肝是魚的重要免疫器官, 有研究表明tyr在體液免疫應答中起作用[39],因此, 我們推測Octyr和Ocslc24a5在西里伯斯青鳉免疫反應過程中可能發揮作用。在胚胎發育過程中,Octyr和Ocslc24a5的轉錄本在2-細胞期就被檢測到, 表明它們是母性遺傳的。西里伯斯青鳉通常在胚胎發育到第9天時孵化, 在7個被測試的胚胎發育時期中,Octyr和Ocslc24a5的相對表達水平均在胚胎發育到第7天時最高, 在這個孵化的關鍵時期,幼魚容易受到外界病原體的影響, 因此Octyr和Ocslc24a5的高表達可能與提高孵化期免疫力相關。在孵化成小魚后,Octyr和Ocslc24a5的相對表達水平明顯降低。這種現象與黃顙魚[6]、爪蟾[7]和山羊[37]相似,tyr和slc24a5的表達水平在孵化前的幾個階段相對較高。這些結果表明了Octyr和Ocslc24a5與西里伯斯青鳉體色形成密切相關。

3.3 Octyr和Ocsl24a5 在胚胎中的時空表達分析

在斑馬魚tyr的研究中,tyr首先在視網膜色素上皮的背側端發現轉錄, 隨后在中腦、間腦、后腦和背側轉錄本中被觀察到[40]。在文昌魚的研究中,tyr分布在文昌魚發育的各個時期[35]。西里伯斯青鳉Octyr同樣分布在胚胎發育的各個時期,Octyr首先在背部被檢測到, 隨著胚胎發育,Octyr在眼睛、皮膚和腦等部位表達, 且表達逐漸增加。在爪蟾中,2-細胞期注射Morpholino導致爪蟾眼睛和表皮的黑色素沉著減少, 在2-細胞期注射人類slc24a5能夠挽救Morpholino帶來的黑色素沉著減少[7]。slc24a5的表達模式與tyrp-2的表達模式相似,tyrp-2是一種已知的黑素團標記基因, 在斑馬魚胚胎中, 在黑素團和視網膜色素上皮細胞中均檢測到slc24a5和tyrp-2[38], 充分說明slc24a5的表達確實存在于黑素團中。這種表達模式與斑馬魚胚胎中所見的表達模式一致。Ocslc24a5的轉錄在中腦、間腦、后腦、背側和眼睛中均被檢測到。隨著胚胎的發育, 在胚胎中檢測到更多的Ocslc24a5信號。這表明西里伯斯青鳉的體色在胚胎期可能已經形成,Octyr和Ocslc24a5不僅與有西里伯斯青鳉體色形成相關, 也可能在西里伯斯青鳉的胚胎發育過程中發揮作用。

綜上, 本研究克隆了西里伯斯青鳉Octyr和Oc-slc24a5的全長cDNA, 并進行了生物學分析, 闡明了Octyr和Ocslc24a5在西里伯斯青鳉胚胎中的時空表達模式。后續將采用分子生物學技術, 如CRISPR/Cas9或者Morpholino注射, 敲除或敲降Octyr和Ocslc24a5的表達, 以進一步了解這兩個基因在西里伯斯青鳉黑色素合成中的調控作用。我們的研究為闡明青鳉屬的黑色素合成奠定了基礎,Octyr和Ocslc24a5在西里伯斯青鳉黑色素合成中的作用、表達及調控機制有待進一步研究。