黑木耳“面包菌”病致病菌株的分離鑒定及生物學特性

隋昆澎 李長田 李 丹 李 玉

黑木耳“面包菌”病致病菌株的分離鑒定及生物學特性

隋昆澎 李長田 李 丹*李 玉

（吉林農業大學食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春 130118）

黑木耳“面包菌”病是一種發生在黑木耳代料栽培中的競爭性病害，其發病特征不易察覺、傳播蔓延速度快，發病后的菌包將無法出耳，給企業和種植戶造成較大損失。通過對吉林省黑木耳栽培主產區發生的疑似黑木耳“面包菌”病的菌包進行調查，以及對染病菌包致病菌株的分離純化、形態學和分子生物學鑒定、系統發育分析以及致病性檢測，確定引起黑木耳“面包菌”病的致病菌株為黃孢原毛平革菌（）。對致病菌株進行生物學特性研究，發現其菌絲的最適生長條件為：溫度30 ℃，可溶性淀粉作碳源，蛋白胨作氮源，pH 6.0，完全黑暗。光照對菌絲體生長有一定的抑制作用。

黑木耳；“面包菌”病；黃孢原毛平革菌；生物學特性

黑木耳（），又名木耳、光木耳，隸屬于擔子菌門、蘑菇綱、木耳目、木耳科、木耳屬[1]。黑木耳多糖含量極高，還富含蛋白質、脂肪、維生素、無機鹽和粗纖維等成分[2]，具有抗腫瘤、抗肝炎、抗潰瘍、抗輻射、抗衰老、降血脂、抗凝血、增強人體免疫功能等作用[3-5]。

作為精準扶貧的重要抓手之一，近年來我國食用菌種植量大幅增長[6]，其中，黑木耳已成為我國第二大食用菌品種，2018年產量達674.03萬噸，占我國食用菌總產量的17.54%[7]。而黑木耳病蟲害的發生，給企業和菇農造成巨大損失。

黑木耳病害主要可分為侵染性病害和競爭性病害，兩者在病原物種類、發生時期、發病條件、危害情況和防控技術等方面存在諸多差異。侵染性病害會直接導致菌絲萎縮、凋亡，如黑木耳黑疔病等[8]。競爭性病害則與黑木耳菌絲爭奪養料，阻礙菌絲體在培養基質中的正常生長，對黑木耳栽培生產危害大，一旦發生就很難防治，造成黑木耳的產量和質量下降[9,10]。黑木耳栽培過程中的主要競爭性致病菌有綠色木霉[11]、青霉spp.[12]、曲霉spp.[13]、脈孢霉spp.[14]等。

黑木耳“面包菌”病也是競爭性病害，研究表明其致病菌為黃孢原毛平革菌[15]，此致病菌適應性強，傳播蔓延速度快，染病初期為白色斑塊，后連成片，白粉狀，與黑木耳菌絲不易區分，后期局部灰黃色，一周左右即可長滿菌袋。染病后栽培基質袋料分離，消耗明顯，如同面包一樣松軟，因而得名。黑木耳菌包被綠色木霉或鏈孢霉污染，雖然會造成減產，但不影響菌包繼續出耳。而“面包菌”一旦爆發，菌包將不再出耳，病害嚴重時幾乎絕收。

目前，研究報道僅限于對該病害的分離鑒定，迫切需要對其生物學特性、適宜發生條件及防治方法等進行系統研究，以提出綜合防控措施。

本文對吉林省黑木耳主產區的黑木耳“面包菌”病進行調查，對其致病菌株進行分離純化、形態學和分子生物學鑒定、系統發育分析以及致病性檢測，并對致病菌株的生物學特性進行了研究，以期為該病害的早期診斷和科學防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病害調查

2019年6月，分別對吉林省蛟河市、汪清縣和安圖縣的黑木耳基地進行“面包菌”病害調查，共調查黑木耳菌包900袋，分3次重復。選取不同地區的黑木耳棚，每個棚100袋，記錄發病菌包的數量和癥狀等。共采集典型病例的黑木耳菌包樣本10個，帶回實驗室用于病菌分離培養。

1.2 致病菌株的分離、純化及保存

將采集到的發病菌包先用酒精擦拭菌包表面，然后用經消毒的解剖刀切開發病部位，用接種針挑取離正常木耳菌絲1～2 cm處的發病部位的袋料，接種到平板培養基中，恒溫箱內培養。觀察培養情況，并不斷挑取單一菌落轉皿分離保存。經多次純化后獲得純培養物，此時培養皿內只存在單一的菌落形態[16]。挑取純培養的菌塊接種到試管內，待長滿整個試管后，4 ℃保藏備用。試驗對10個發病菌包分別進行病菌分離培養，共獲得10個菌株。

1.3 致病菌株的鑒定

（1）形態學鑒定。將從栽培基料上分離純化得到的致病菌株菌絲或分生孢子挑到PDA平板上，置于25 ℃恒溫培養箱中培養并觀察，待菌落形成而分生孢子剛產生時制片，在顯微鏡下觀察分生孢子梗和分生孢子的形態特征，并進行數碼照相。

隨機選取一個視野，測量記錄致病菌株的分生孢子梗、分生孢子、分生孢子器的大小，觀察致病菌株的產孢方式以及分生孢子的形狀、顏色等，并在40倍、100倍下進行數碼顯微拍攝。參照文獻[15]所描述的致病菌株的形態特征，進行致病菌株種類鑒定，以明確致病菌株的分類地位。

（2）分子生物學鑒定。將待測致病菌株在PDA平板活化后，挑取其平板培養物（7 mm小菌塊3塊）接種到鋪有玻璃紙的PDA平板上，在25 ℃下避光培養5 天。使用基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）提取致病菌株菌絲體基因組DNA，方法詳見說明書。經1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測后，確定基因組提取質量。

選用真菌通用引物ITS1-F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS4-B（5'-CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG- 3'），進行rDNA ITS-PCR擴增。PCR擴增體系（20 μL）：11.4 μL雙蒸無菌水，2 μL 10×buffer，2 μL MgCl2（25 mmol/L），0.4 μL dNTP（10 mmol/L），引物ITS1和ITS4各1 μL，2 μL模板DNA，0.2 μL Taq酶（Thermo）。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，然后94 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共28個循環，最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測確認，送至華大基因公司進行測序。將測序結果在GenBank（NCBI，http://www.ncbi.nlm.gov）中進行BLAST序列分析，從GenBank中選取合適的序列下載，經ClustX 1.83軟件進行多重序列對比，再用PAUP軟件構建系統發育樹。依據系統發育關系，確定菌株的分類地位。

1.4 致病性檢測

將純化后的致病菌株和黑木耳的菌絲同時分別接種在菌袋（26 cm×15 cm）兩端的培養料中，共接種9個菌袋，于25 ℃下避光培養15 天后觀察并記錄發病情況。若出現病癥，對發病部位再次進行分離和鑒定[17]，檢測發病菌包中能否分離出黑木耳菌株，同時通過質構儀和電子秤對發病菌包進行硬度和重量測定。

1.5 致病菌株的生物學特性研究

（1）培養基配方。碳源試驗培養基：3.0 g磷酸二氫鉀、2.0 g酵母膏、2.0 g蛋白胨、1.5 g硫酸鎂、15.0 g瓊脂、20.0 g碳源、1.0 L蒸餾水，pH自然。分別以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、糊精粉、可溶性淀粉作為碳源，并設立空白對照。

氮源試驗培養基：1.5 g硫酸鎂、3.0 g磷酸二氫鉀、20.0 g葡萄糖、15.0 g瓊脂、20.0 g氮源、1.0 L蒸餾水，pH自然。分別以蛋白胨、酵母膏、酵母浸粉、磷酸氫二銨、亞硝酸鈉作為氮源，并設立空白對照。

pH試驗培養基：使用1.0 mol/L鹽酸和1.0 mol/L氫氧化鈉將滅菌后PDA培養基的pH分別調至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。

溫度及光照試驗采用PDA培養基，pH自然。

（2）溫度對致病菌株菌絲長速的影響。將15.0 mL PDA培養基倒入培養皿（φ=9.0 cm）中，將直徑為7.0 mm的接種塊接入到PDA培養基中央，每組設置6次重復，分別置于15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃的恒溫培養箱中進行黑暗培養。采用“十”字交叉法，在菌絲萌發后每隔12 h測量菌絲長度并記錄試驗數據。當培養2 d后，根據菌絲在培養皿上標記的菌落直徑，計算菌絲生長速率。

菌絲生長速率=（第2 d所測菌落直徑? 接種塊直徑）/ 2。

所得數據用SPSS 1.9軟件進行方差分析。

（3）不同碳源對致病菌株菌絲長速的影響。分別將15.0 mL不同碳源的試驗培養基倒入培養皿（φ=9.0 cm）中，將直徑為7.0 mm的接種塊接入到PDA培養基中央，每組設置6次重復，置于25 ℃恒溫培養箱中進行黑暗培養。測量分析方法同1.5（2）。

（4）不同氮源對致病菌株菌絲長速的影響。分別將15.0 mL不同氮源的試驗培養基倒入培養皿（φ=9.0 cm）中，將直徑為7.0 mm的接種塊接入到PDA培養基中央，每組設置6次重復，置于25 ℃恒溫培養箱中進行黑暗培養。測量分析方法同1.5（2）。

（5）pH對致病菌株菌絲長速的影響。將15.0 mL pH不同的試驗培養基倒入培養皿（φ=9.0 cm）中，將直徑為7.0 mm的接種塊接入到PDA培養基中央，每組設置6次重復，置于25 ℃恒溫培養箱中進行黑暗培養。測量分析方法同1.5（2）。

（6）光照對菌絲體生長的影響。將直徑為7.0 mm的接種塊接入到PDA培養基（φ=9.0 cm）中央，分別設置完全光照（24 h光照）、完全黑暗（24 h黑暗）、光暗交替（12 h光照，12 h黑暗）3個處理，每個處理6次重復，25 ℃恒溫培養。測量分析方法同1.5（2）。

2 結果與分析

2.1 病害的發生情況

對吉林省蛟河市、汪清縣、安圖縣黑木耳栽培基地進行病害調查的結果顯示，該地區黑木耳“面包菌”病的平均發生率為7%左右（表1）。致病菌菌絲白色，很難與黑木耳菌絲相區分。調查時用手觸摸菌包，正常菌包質地堅硬，而發病菌包由于基質被病菌快速分解利用，體積縮小，質地軟化，手感似軟面包，并出現嚴重的袋料分離現象。

表1 不同調查基地黑木耳“面包菌”病的發病情況

地點調查時間調查袋數發病袋數發病率/% 吉林省蛟河市2020.6.9100 5 5.00 吉林省蛟河市2020.6.10100 7 7.00 吉林省蛟河市2020.6.11100 6 6.00 吉林省汪清縣2020.6.16100 8 8.00 吉林省汪清縣2020.6.17100 5 5.00 吉林省汪清縣2020.6.181001010.00 吉林省安圖縣2020.6.21100 4 4.00 吉林省安圖縣2020.6.22100 6 6.00 吉林省安圖縣2020.6.23100 9 9.00

2.2 致病菌株分離與鑒定結果

本試驗對10個染病菌包進行了致病菌株分離培養，獲得10個菌株，觀察結果顯示各菌株菌落形態和顯微形態特征均一致，判斷為同一種真菌。并對代表菌株PC01進行形態學和分子鑒定。

（1）形態學鑒定。普通光學顯微鏡下40×菌株PC01的菌絲和孢子形態圖如圖1（A、B、C）所示，100×如圖1（D）所示。顯示菌株PC01菌絲具有以下特征：菌絲體發達，在平板上呈擴散狀生長，有隔有分枝，小分枝頂端著生孢子或厚垣孢子，小分枝大小一般為7.5～10 μm×5～7.5 μm。

厚垣孢子呈淺黃色，通過小枝與菌絲體連接，一般著生于菌絲體分枝的起始位置，呈亞圓形或橢圓形。分生孢子呈梨形、亞圓形或橢圓形，表面光滑，無隔，無色，大小為7～10 μm×5～7.5 μm。宏觀看，產孢量極大，呈白色粉末狀遍布整個菌落表面。

（2）分子生物學鑒定。經對菌株PC01的rDNA ITS-PCR擴增和測序，獲得片段長度為604 bp的DNA序列（序列已上傳至GenBank，登錄號為SUB8393371）。經NCBI數據庫Blast搜索比對，發現該序列與的序列相似性達99%，應為同一個物種。利用PAUP與同屬的44個不同種采用最大簡約法構建了系統發育樹（圖2）。分析結果表明，菌株PC01的序列比對結果與匹配。結合宏觀經典分類學數據，進一步確定該致病菌株為黃孢原毛平革菌。其生物學分類為：擔子菌門Basidiomycota、蘑菇綱Agaricomycetes、多孔菌目Polyporales、伏革菌科Phanerochaetaceae、顯革菌屬。

2.3 致病性檢測

將回接病原菌PC01的菌包與對照在25 ℃下避光培養15 天后，回接菌包出現與病原地所采集樣品同樣的發病癥狀（圖3）。再次對回接菌包進行菌株分離，可得到致病菌株PC01，而無法分離得到黑木耳菌株。硬度和重量測定結果表明，染病菌包平均硬度和重量分別為663.54 g和491.65 g，較正常健康菌包的硬度（2091.31 g）和重量（608.57 g）分別減少68%和19%。可見，黃孢原毛平革菌為黑木耳“面包菌”病的致病菌株。

圖2 基于ITS和LSU基因序列聯合分析的最大簡約樹

注：陰影處為致病菌株的系統發育位置，MLBP（左）＞50%和MPBP（右）＞50%的值在圖中標注。

2.4 致病菌株生物學特性

（1）溫度。不同溫度下菌株PC01的菌絲生長速率見圖4，差異顯著，從大到小依次為30 ℃> 35 ℃>25 ℃>20 ℃>15 ℃。30 ℃下菌絲生長最快，也最濃密。

（2）碳源。菌株PC01的菌絲在5種碳源培養基上的生長速率總體差異不大（表2），但長勢有不同，以可溶性淀粉培養基的菌絲長勢好、濃密且生長速率顯著快于其他處理。不同碳源培養基的生長速率由大到小為：可溶性淀粉>蔗糖>麥芽糖>糊精>葡萄糖，最適碳源為可溶性淀粉。

A. 健康黑木耳菌袋（CK）；B. 回接致病菌株菌包

圖4 溫度對菌絲生長的影響

（3）氮源。菌株PC01的菌絲在不同氮源培養基上的長勢差異較大，并且生長速率和菌絲密度各不相同（表3）。蛋白胨培養基上的菌絲生長速率最快，菌絲最為濃密；而亞硝酸鈉培養基上的菌絲未生長。菌株PC01菌絲在不同氮源培養基中生長速率由大到小為：蛋白胨>酵母浸粉>酵母膏>磷酸氫二銨>亞硝酸鈉，最適氮源為蛋白胨，而選擇亞硝酸鈉作為氮源對該菌絲有明顯的抑制作用。

表2 不同碳源對黃孢原毛平革菌菌絲體生長的影響

碳源菌落顏色菌落邊緣整齊度菌絲長勢菌絲生長速率*/(cm/d) 葡萄糖白整齊+4.44±0.0750 b 蔗糖白整齊++4.67±0.0828 b 麥芽糖灰白整齊++4.66±0.0577 b 糊精灰白整齊++4.58±0.0619 b 可溶性淀粉白整齊+++5.00±0.1892 a 對照(CK)白整齊++4.41±0.0210 b

注：同列數據后小寫字母不同表示在<0.05水平上差異顯著；+++表示菌絲濃密、健壯，++表示菌絲較密、長勢一般，+表示菌絲長勢弱；*數據為6次的平均值和標準差。表3同。

表3 不同氮源對黃孢原毛平革菌菌絲體生長的影響

氮源菌落顏色菌落邊緣整齊度菌絲長勢菌絲生長速率/ (cm/d) 蛋白胨白整齊+++5.35±0.0799 a 酵母膏灰白整齊++5.01±0.0968 b 酵母浸粉灰白整齊+++ 5.23±0.1137 ab 磷酸氫二銨白不整齊+3.41±0.0498 c 亞硝酸鈉---- 對照(CK)灰白整齊++5.00±0.1931 b

注：“-”代表菌絲未生長。

（4）pH。pH對菌株PC01菌絲生長速率影響大（圖5）。當pH為6.0時，菌絲生長最快；pH為5.0時，生長最慢。不同pH培養基菌絲生長速率由大到小為：6.0>7.0>8.0>9.0>5.0。pH在5.0～8.0范圍內，菌絲生長均較濃密。

（5）光照。菌株PC01菌絲體生長受光暗條件影響較大，不同光照處理間存在顯著差異（圖6）。以完全黑暗條件下菌絲體生長速率最快，為3.99 cm/d，表明光照對菌絲體生長有一定的抑制作用。

3 結論與討論

近年來，吉林地區黑木耳“面包菌”病時常爆發，對黑木耳生產造成不良影響。本研究確定了從吉林省收集的黑木耳“面包菌”菌包致病菌為黃孢原毛平革菌，并發現該菌喜溫暖（最適溫度為30 ℃）、偏酸性（pH 6.0）生長條件，而黑木耳菌絲生長最適溫度則為25～28 ℃，最適pH 5.0～6.0[18]。因此，中溫培養更能在抑制黃孢原毛平革菌菌絲體生長的同時，促進黑木耳菌絲體生長。

圖5 pH對黃孢原毛平革菌菌絲長速的影響

圖6 光照對黃孢原毛平革菌菌絲體生長的影響

本研究結果顯示，黑暗環境更有利于黃孢原毛平革菌菌絲體生長，光照存在一定的抑制生長作用，這與靈芝蛛網病病原菌[19]和斑玉蕈蛛網病病原菌[20]的研究結果類似。因此，在不影響黑木耳菌絲正常生長的情況下，提供一定時間的光照，避免長時陰暗，有利于“面包菌”病害的防控。

黃孢原毛平革菌菌絲生長的最適碳、氮源分別為可溶性淀粉和蛋白胨，而亞硝酸鈉作為氮源對其有明顯抑制作用。黑木耳菌絲生長最佳碳源是蔗糖，葡萄糖次之；最佳氮源是酵母浸粉[21]。可利用此差異，在黑木耳培養過程中選擇添加適當的碳、氮源。

黃孢原毛平革菌具有分泌木質素過氧化物酶（Lip）[22]、錳過氧化物酶（Mnp）[23]及其他酶類的能力，被廣泛應用于造紙、污水處理等工業研究領域[24-27]。但其作為黑木耳生產中的競爭性雜菌，降解培養基質速度及菌絲生長速度遠超黑木耳，導致黑木耳菌絲體無法生長而絕收，造成較大經濟損失[15]。目前，關于“面包菌”病害的種類還存有爭議，尚無證據證明致病過程中黑木耳菌絲被黃孢原毛平革菌菌株侵染，是否發生重寄生現象還有待驗證。

由于黃孢原毛平革菌與黑木耳同屬于白腐真菌，兩者生長所需的環境條件相似，對該病害的防治造成較大困難。建議在黑木耳栽培生產過程中，嚴格把控每個環節，培養料要充分拌勻，預濕透徹，滅菌徹底；篩選使用優良菌種，規范菌種制作及接種操作；調控好菇房內環境，注意通風。

目前，食用菌生產中可使用的殺菌劑很少，一些殺菌劑如百菌清等雖然對病原真菌有強抑制作用，但也同樣抑制食用菌菌絲生長。礦質元素銅是食用菌栽培中理想的殺菌劑，可有效抑制病原真菌生長，對食用菌生長影響較小，但其會提高食用菌的銅含量。銅元素在人機體代謝中起著生物催化劑作用，銅攝入量過低會導致貧血、發育不良等癥狀，嚴重時可引起白癜風等疾病[28]，而銅攝入過量又會危害人體健康[29]。因此，利用銅元素作為食用菌殺菌劑還有待于進一步研究。

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Identification and biological characteristics of “bread fungus” disease of

Sui Kunpeng Li Changtian Li Dan1*Li Yu

（Engineering Research Center of Chinese Ministry of Education for Edible and Medicinal Fungi, College of Agronomy, Jilin Agricultural University, Changchun, Jilin 130118, China）

The “bread fungus” disease ofis a competitive disease that occurs insubstituting cultivation. The characteristics of the disease are not easy to detect at the beginning, and spread quickly, greatly impacts on yield after infection. This study identified a pathogenic strain from cultivation substrate ofinJilin Province where is one of the main production regions in China. Isolation and purification test of pathogenetic fungi was conducted, and the results showed thatleads “bread fungus” disease through morphological, phylogenetic and pathogenicity test. The study of biological characteristics of pathogenic strains showed that the optimum growth conditions were as follows: temperature 30 ℃, soluble starch as carbon source, pH 6.0 and peptone as nitrogen source. The light inhibited the growth of mycelial, while darkness stimulated mycelial growth. This study provides a useful reference for effective control of the “bread fungus” disease ofr.

; “bread fungus” disease;; biological characteristics

S646

A

2095-0934（2022）02-119-08

國家重點研發計劃（2021YFD1600401）；中國科學院戰略性先導科技專項（XDA28080304）

隋昆澎（1995—），男，在讀碩士，主要從事食用菌栽培與病害防治。E-mail：skp744459033@163.com。

李丹（1983—），女，博士，實驗師，現主要從事食藥用菌病害研究工作。E-mail：lidan@jlau.edu.cn。