乳腺癌組織中HPV 感染與TLR4、NF-κB 蛋白表達的關系及其臨床意義

石 喆 任 珊 楊 立 戴文斌

1.廣西壯族自治區柳州市人民醫院病理科，廣西柳州 545001；2.廣西壯族自治區柳州市人民醫院檢驗科，廣西柳州 545001

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，在我國，乳腺癌的發病率和死亡率位居女性惡性腫瘤的第一位和第六位，嚴重威脅女性的生命健康[1]。目前乳腺癌的5 年生存率可達90%，但乳腺癌患者耐藥、復發、轉移等預后不良的現象仍然十分常見[2]，探討乳腺癌發生發展的分子機制，尋找新的診斷標志物和治療靶點是當前研究的重點。研究表明，人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染可能在乳腺癌的侵襲中起關鍵作用[3-4]。Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是最近發現的模式識別受體家族，是先天免疫系統的重要組成部分，在宿主防御的第一道防線中發揮重要作用，但有證據表明TLR4 激活與癌癥免疫抑制和生長有關[5]。核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）已被證實參與調控細胞增殖、分化、凋亡及惡性轉化，涉及炎癥與腫瘤的發生發展機制[6]。TLRs 通過誘導NF-κB途徑阻止免疫應答的激活或增強炎癥而與惡性轉化相關。本研究采用免疫組織化學染色法檢測乳腺浸潤性癌、導管上皮非典型增生（atypical ductal hyperplasia，ADH）和正常乳腺組織標本中HPV16/18E6、TLR4和NF-κB 蛋白的表達，探討乳腺癌中三者表達的關系及其與臨床病理特征的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇廣西壯族自治區柳州市人民醫院乳腺外科2018 年1 月至2019 年12 月手術切除浸潤性癌乳腺標本50例為癌組、ADH 乳腺標本30例為ADH 組、正常乳腺組織30例為正常組。納入標準：①柳州地區女性患者；②首次診斷乳腺癌且臨床病理資料完整；③兩名經驗豐富的病理醫師對所有組織病理學結果進行審核確認。排除標準：①合并其他部位惡性腫瘤、懷孕及諸如類風濕性關節炎的全身性炎癥性疾病；②有放療、化療、內分泌治療及其他生物抗癌治療等抗腫瘤手段治療的既往史或現病史。癌組參照2012 年世界衛生組織乳腺腫瘤分類標準進行病理診斷及分期。組織學類型：非特殊型34例，特殊型16例（浸潤性小葉癌8例、黏液癌5例、伴髓樣分化癌3例）；組織學分級：Ⅰ級8例、Ⅱ級29例、Ⅲ級13例；pTNM分期：Ⅰ期8例、Ⅱ期31例、Ⅲ～Ⅳ期11例；有淋巴結轉移25例，無淋巴結轉移25例。從乳腺纖維腺瘤手術獲得的30 個瘤旁正常組織標本作為正常組，所有正常組均為健康女性，無雌激素治療史、口服避孕藥、宮頸癌和吸煙史。癌組年齡16～80 歲，平均（48.97±11.43）歲。ADH 組年齡21～71 歲，平均（45.83±11.87）歲。正常組年齡21～72 歲，平均（46.86±11.16）歲。三組年齡比較，差異無統計學意義（P ＞0.05），具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準，符合醫學倫理學標準，所有檢測方法均獲得患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標本處理 所有標本用10%中性緩沖福爾馬林固定，常規制片，切片厚度4 μm，HE 染色，鏡下觀察。

1.2.2 免疫組織化學染色 即用型小鼠單克隆抗體HPV16/18E6（克隆編號C1P5，貨號：GR3225702-14）、TLR4（克隆編號76B357.1，貨號：GR3309592-1）及兔多克隆抗體NF-κB p65（貨號：GR3309481-1）均購于Abcam 公司（Abcam，Cambridge，MA，USA），稀釋濃度均為1∶100。免疫組織化學染色技術采用MaxVison法，試劑盒（貨號：Kit-0014）購于福州邁新生物技術開發有限公司。嚴格按說明書進行操作，用pH 6.0 檸檬酸鈉緩沖液進行抗原修復。用已知宮頸癌HPV16/18E6、TLR4 和NF-κB 陽性切片做陽性對照，PBS 緩沖液取代一抗做陰性對照。

1.3 結果判定

由兩位副高級以上職稱病理醫師采用雙盲法進行判讀。HPV16/18E6 與NF-κB 蛋白以細胞質和/或細胞核、TLR4 蛋白以細胞膜和/或細胞質呈黃色或棕黃色為陽性染色。TLR4、NF-κB 蛋白染色判讀標準：隨機取400 倍光鏡下5 個視野，每個視野計數100 個細胞。①陽性細胞百分比評分：無陽性細胞為0 分，陽性細胞數占1%～25%為1 分，＞25%～50%為2 分，＞50%～75%為3 分，＞75%～100%為4 分；②著色強弱評分：無著色0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。以兩者的乘積判定結果，≤3 分為陰性組，＞3 分為陽性組。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0 軟件行數據分析。計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數資料用例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，兩兩比較采用Bonferroni 校正；相關性分析用Spearman相關系數。以P <0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組HPV16/18E6、TLR4 與NF-κB 蛋白的表達情況

HPV16/18E6 蛋白棕黃色顆粒定位于細胞質及細胞核，見圖1；TLR4 蛋白定位于細胞膜及細胞質，見圖2；NF-κB 蛋白陽性定位于細胞質或細胞核，見圖3。三組HPV16/18E6、TLR4 與NF-κB 蛋白陽性表達率比較，差異有高度統計學意義（P<0.01）。癌組HPV16/18E6 陽性表達率高于ADH 組和正常組，差異有統計學意義（P <0.017）；癌組TLR4、NF-κB 蛋白陽性表達率高于ADH 組、正常組，ADH 組陽性表達率高于正常組，差異有統計學意義（P <0.017）。見表1。

表1 三組HPV16/18E6、TLR4 和NF-κB 蛋白陽性表達率比較[例（%）]

2.2 ADH 組及癌組中HPV16/18E6 與TLR4、NF-κB蛋白的相關性

ADH 組及癌組中HPV16/18E6 與TLR4、NF-κB蛋白呈正相關（P <0.01）。見表2。

表2 癌組及ADH 組中HPV16/18E6 與TLR4、NF-κB 蛋白的相關性（例）

2.3 ADH 組及癌組中TLR4 與NF-κB 蛋白的相關性

ADH 組及癌組中TLR4 與NF-κB 蛋白呈正相關（P <0.01）。見表3。

表3 ADH 組及癌組中TLR4 與NF-κB 蛋白的相關性（例）

2.4 癌組中HPV16/18E6、TLR4 及NF-κB 蛋白陽性表達與臨床病理特征的關系

HPV16/18E6、TLR4 及NF-κB 蛋白陽性表達率與組織學分級、腫瘤直徑、淋巴結轉移及臨床病理分期有關（P<0.05），與年齡、組織學類型無關（P>0.05）。見表4。

表4 HPV16/18E6、TLR4 和NF-κB 蛋白陽性表達與臨床病理特征的關系[例（%）]

3 討論

乳腺癌發病率和死亡率的增加突出了乳腺癌識別與發展相關的新致病因素的重要性。研究顯示，病毒感染涉及18%～20%的乳腺癌發生[7-8]，并證實在乳腺癌組織中有HPV 感染的存在，HPV16、18型是最常見的類型[9-10]。研究發現，在同一患者中發生HPV 陽性乳腺癌之前其良性乳腺組織中存在HPV 感染的證據[11]。HPVE6 和E7 癌蛋白通過結合和抑制p53 和p110RB 腫瘤抑制基因，破壞細胞周期調節，在乳腺癌的發生中有潛在作用[12-13]。但有研究顯示，HPV 感染與乳腺癌的發生無相關性[14-15]。本研究結果顯示，癌組HPV16/18E6 陽性表達率高于ADH 組和正常組（P <0.017），提示HPV 感染涉及乳腺癌的發生過程，HPV16/18E6 在乳腺組織中的表達是檢測活動性感染的可靠標志。

持續性HPV 感染可以由于某些特征（包括產生致癌蛋白）誘導活性氧氮分子產生，促進有絲分裂和產生血管生成因子等引發慢性炎癥。TLR 作為模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR），能夠激活多種病原體相關分子模式并與其他PRR 家族相互作用發生一系列信號轉導，產生各種炎癥介質。炎癥性免疫反應的后果有兩個方面：一方面，它使生物體能夠抵御感染；另一方面，持續炎癥環境可以促進腫瘤細胞免疫逃逸。逃避免疫腫瘤監測是癌癥的一個公認特征，在與HPV相關的腫瘤中，HPV 可導致這種逃逸的發生[16]。在HPV 感染期間TLRs 過度表達，誘導NF-κB 途徑阻止免疫應答的激活或增強炎癥，啟動HPV16E6/E7 的活性而與惡性轉化相關。TLR4 是唯一能夠激活銜接蛋白髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依賴性和獨立途徑的配體。MyD88 被TLR4激活后，啟動參與促炎、抗病毒和抗菌反應的一組特定基因的轉錄，促進NF-κB 活化，導致炎癥細胞因子的產生[17-21]。據報道[22]，TLR4/NFκB 信號通路的異常刺激涉及許多自身免疫性疾病和慢性炎癥，NF-κB 調節腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白細胞介素-1（interleukin，IL-1）、IL-6、細胞周期蛋白D1、c-MYC 等導致細胞增殖，調節血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、TNF、IL-1 和IL-8 有助于血管生成，從而有利于腫瘤發生。NF-κB 在腸癌、胰腺導管癌、肝癌、卵巢癌、非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤中高表達，且與腫瘤的轉移性密切相關。在乳腺癌細胞系和患者中觀察到NF-κB 通路中的抑制蛋白激酶ε的擴增和過表達，進一步強調了NF-κB 與乳腺癌的關系[23-24]。本研究結果顯示，癌組HPV16/18E6 陽性表達率高于ADH 組和正常組，癌組TLR4、NF-κB 蛋白陽性表達率高于ADH 組（P <0.017）。癌組及ADH 組中HPV16/18E6 與TLR4、NF-κB 蛋白呈正相關（P <0.01）；TLR4與NF-κB 蛋白呈正相關（P<0.01），提示炎癥在HPV16/18E6 陽性乳腺癌誘導中起重要作用。本研究結果顯示，HPV16/18E6、TLR4 與NF-κB 蛋白陽性表達率與組織學分級、腫瘤直徑、淋巴結轉移及臨床病理分期有關（P <0.05）。提示HPV16/18E6、TLR4 與NFκB 蛋白在乳腺癌的發展、浸潤轉移中起著重要的作用。

綜上所述，高危型HPV 感染與乳腺癌的發生、發展有關，HPV 感染導致TLR4/NF-κB 信號通路的異常可能與乳腺癌患者預后不良之間有一定的關聯，TLR4、NF-κB 可作為新的預后生物標志物應用于乳腺癌預后的評價。將HPV 疫苗、調節TLR4/NF-κB 信號通路以及TLR4 拮抗劑作為乳腺癌的預防和治療策略，可能在防御癌癥或改善預后方面具有廣泛應用前景。