理筋手法干預對頸后肌慢性損傷家兔β-EP、ENK、5-HT動態變化的影響

袁蘭英 馬惠昇,2* 穆 靜 李嫚嫚 李彥雙 孫文靜

1.寧夏醫科大學中醫學院，銀川 750004；2.寧夏醫科大學回醫藥現代化省部共建教育部重點實驗室，銀川 750004

隨著工作和生活中電子設備的廣泛應用，教師及職場工作者等人群持續長時間低頭伏案工作頻率大大增加[1]。頸部采取低頭位、頸前伸的姿勢，來代償頸部胸鎖乳突肌、斜方肌、頸后肌群高度緊張現象，造成出現頸部自覺不適、頸后肌群僵硬疼痛、頭痛等問題[2-3]。雖然在疼痛初期經休息后可緩解，但是易復發，長期持續會誘發頸部疾病產生，增加了治療成本，又對人們的工作生活產生長期的影響[4-5]。唐代孫思邈在《備急千金要方·卷九》中指出：“凡人有少苦似不如平常，即須早道，當若隱忍不治，希望自差，須臾之間，已成痼疾?！盵6]也認為當身體出現不適時，如果勉強忍受不進行干預，過不了多久不適感就會形成頑疾。因此，當處于未病的狀態時就要通過干預防止其進一步發展成為疾病，實現“上醫醫未病之病”理念的同時解除患者的痛苦。研究[7-8]發現，中樞鎮痛機制中激活內源性阿片肽ENK與β-EP能夠達到鎮痛的作用，外周中β-EP、5-HT作為經典的致痛遞質，也參與痛敏形成的過程。課題組在前期研究中發現理筋手法干預治療頸后肌慢性損傷療效顯著[9]，但其如何發揮干預疾病形成的機制尚不明確。本研究通過建立家兔頸后肌慢性損傷模型，研究理筋手法對家兔頸后肌慢性損傷相關因子β-EP、ENK、5-HT含量的影響，探索理筋手法對人頸后肌慢性損傷的干預機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用普通級健康日本大耳家兔63只，6月齡，雌雄各半，體重(2.0±0.5)kg，由陜西君行生物科技有限公司提供[許可證號：SCXK(陜)2017-001]，在寧夏醫科大學雙怡校區實驗動物中心進行飼養。實驗所用家兔分籠飼養，食用標準兔飼料和水，自由飲食。室溫15～20 ℃，濕度50%～60%。

1.2 分組及造模方法 63只成年家兔適應性喂養1周，在觀察其飲食、糞便、活動均無異常后開始實驗。按照標準隨機數字表法，將63只家兔隨機分為正常對照組組、模型組、干預組，每組21只。由專人定時定量喂養。根據前期課題組實驗，參照劉志華等[10]所改良的頸部模型固定架建立兔頸后肌慢性損傷模型。根據前期課題組對兔慢性靜力性損傷造模方式、造模持續時間的反復研究，最終采用每日1次，一次5 h，固定60 d的方式進行慢性靜力性損傷造模。

1.3 干預方法 正常對照組組家兔正常飼養，不進行造模與干預。模型組家兔在每天造模結束后不予任何處理。干預組家兔在每天造模結束后，立即給予理筋手法干預；由專業人員先在推拿手法測定儀上進行手法力量、頻率等動力學參數訓練，待松筋、順筋手法的動力學參數穩定后對家兔頸后肌處施以松筋、撥筋、順筋的手法治療，治療時手法刺激量以家兔不躁動為宜。理筋手法干預每天1次，每次10～15 min。

1.4 組織標本的采集 在造模后的第20天、40天、60天對各組家兔經耳緣靜脈采集靜脈血10 mL，于-20 ℃冰箱中凍存備用?？諝馑ㄈㄌ幩栏鹘M家兔，剝離頸后皮膚充分暴露頸后肌，取1 cm×1 cm×0.5 cm頸后肌組織，生理鹽水沖洗后放入標記好的包埋盒中，然后置于4%的多聚甲醛固定液中，用于HE染色。將頸段的肌肉與脊柱撥離，用咬骨剪小心剪下頸段脊柱，并用棉簽取出頸段脊髓快速置于EP管中。再取出兔的下丘腦置于EP管中。將取好的樣本快速放入-80 ℃低溫冰箱保存，用于ELISA檢測。

1.5 HE染色觀察頸后肌組織形態學結構變化 將4%的多聚甲醛固定液中的肌組織，按照操作順序，依次脫水、浸蠟、包埋、切片、染色后，再經脫水、透明、封固后在光學顯微鏡下觀察細胞核、胞漿、纖維組織染色情況，觀察炎癥、炎細胞浸潤情況。

1.6 ELISA分別檢測頸部中樞β-EP、ENK及外周β-EP與5-HT含量 檢測頸后肌組織、脊髓、下丘腦中β-EP、ENK與5-HT含量時，從-80°低溫冰箱中快速取出各類待測標本，融化后維持在4 ℃左右，加入一定量PBS將標本進行勻漿處理，勻漿充分后，2000 r·min-1離心20 min，收集上清。按照β-EP、ENK、5-HT的ELISA試劑盒說明書進行操作，于450 nm波長處在酶標儀上讀取各孔的吸光度(OD)值。以OD值為縱坐標,相應的標準品含量為橫坐標，繪制標準曲線。

檢測血漿中β-EP與5-HT含量，取出-80 ℃存放的血漿，恢復至4 ℃左右后添加抗凝劑EDTA混合15 min，2000 r/min離心20 min，收集上清。使用ELISA試劑盒檢測血漿中β-EP與5-HT含量，方法同上。

2 結果

2.1 家兔頸后肌局部組織形態結構變化 在光學顯微鏡下觀察肌纖維如圖1所示，正常對照組處頸后肌肌纖維整齊排列，間隙大致相同。第20天時模型組出現肌原纖維排列紊亂、肌絲扭曲的現象；干預組相較于模型組，肌原纖維紊亂程度較輕；第40天模型組可見肌原纖維排列紊亂、疏松，肌間隙不規則增寬變窄，有少量炎性細胞浸潤；干預組可見局部肌原纖維排列紊亂、扭曲程度較輕，肌間隙增寬；第60天模型組可見肌原纖維排列紊亂、大幅度扭曲變形，間隙不規則變窄，大量炎性細胞浸潤；干預組肌纖維變化較模型組肌纖維排列紊亂、扭曲幅度小。

空白組(20 d) 模型組(20 d) 治療組(20 d)

空白組(40 d) 模型組(40 d) 治療組(40 d)

空白組(60 d) 模型組(40 d) 治療組(40 d)圖1 骨骼肌慢性靜力性損傷后組織形態學變化(HE染色，×200)

2.2 各組家兔頸部中樞(脊髓與下丘腦)內β-EP含量的比較 如表1所示，組間比較中，與正常對照組兔中樞β-EP含量相比，同期三個觀察點處模型組β-EP含量均降低(P<0.05)；與模型組中樞β-EP含量相比，第40天時，干預組脊髓β-EP含量升高(P<0.05)；第60天時，干預組下丘腦β-EP 含量升高(P<0.05)。組內比較中，與模型組第40天中樞β-EP含量相比，第60天脊髓β-EP含量升高(P<0.05)。與干預組第40天中樞β-EP含量比較，第20天下丘腦β-EP含量升高(P<0.05)。

表1 各組家兔中樞(脊髓與下丘腦)中β-EP含量比較

表1 各組家兔中樞(脊髓與下丘腦)中β-EP含量比較

組別 20 d(n=7) 40 d(n=7) 60 d(n=7) 脊髓下丘腦脊髓下丘腦脊髓下丘腦正常對照組914.90±30.38909.62±38.34917.88±30.29921.16±27.95918.91±27.97910.73±29.55模型組838.01±59.95△826.14±29.64△817.56±33.39△839.82±40.48△865.56±46.89△▲812.52±45.12△干預組873.42±50.01867.96±45.92◆889.97±37.37☆805.39±39.98△914.90±30.38919.35±28.02☆

注：與同一時間點正常對照組比較，△P<0.05；與同一時間點模型組比較，☆P<0.05；與40 d模型組比較，▲P<0.05；與40 d干預組比較，◆P<0.05。

2.3 各組家兔頸部中樞(脊髓與下丘腦)內ENK含量的比較 如表2所示，組間比較中，與正常對照組兔中樞ENK含量相比，同期三個觀察點處模型組含量均降低(P<0.05)；與模型組中樞ENK 含量相比，同期三個觀察點處，干預組ENK 含量升高(P<0.05)。組內比較中，與模型組第40天中樞ENK含量相比，第60天ENK含量降低(P<0.05)。與干預組第40天比較，第20天、 60天下丘腦ENK含量均降低(P<0.05)。

表2 各組家兔中樞(脊髓與下丘腦)中ENK含量比較

表2 各組家兔中樞(脊髓與下丘腦)中ENK含量比較

組別 20 d(n=7) 40 d(n=7) 60 d(n=7) 脊髓下丘腦脊髓下丘腦脊髓下丘腦正常對照組493.00±19.85512.11±16.86481.19±20.65509.01±20.68482.27±17.11505.58±21.04模型組393.94±26.71△433.13±20.16△393.47±18.45△433.42±24.56△382.32±11.00△▲404.46±8.42△▲干預組466.57±27.28☆ 481.42±23.56△☆◆461.61±13.85☆506.52±29.70☆ 425.06±9.51△☆◆ 398.42±16.67△◆

注：與同一時間點正常對照組比較，△P<0.05；與同一時間點模型組比較，☆P<0.05；與40 d模型組比較,▲P<0.05；與40 d干預組比較,◆P<0.05。

2.4 各組家兔頸部外周(頸后肌組織與血漿)內β-EP含量的比較 如表3所示，組間比較中，與正常對照組兔外周β-EP含量相比，同期三個觀察點處模型組含量均降低(P<0.05)；與模型組外周β-EP含量相比，同期三個觀察點處，干預組頸后肌組織、血漿β-EP含量升高(P<0.05)。組內比較中，與模型組、干預組第40天外周β-EP含量相比，第20天β-EP含量均升高(P<0.05)。

表3 各組家兔外周(頸后肌組織與血漿)中β-EP含量比較

表3 各組家兔外周(頸后肌組織與血漿)中β-EP含量比較

組別 20 d(n=7) 40 d(n=7) 60 d(n=7) 頸后肌組織血漿頸后肌組織血漿頸后肌組織血漿正常對照組877.00±36.27806.97±35.29876.24±37.65811.84±32.98881.94±35.80812.31±33.19模型組760.68±64.41△▲761.38±28.32△▲710.53±35.72△652.60±43.09△665.41±26.67△▲663.77±47.86△干預組827.56±19.73△☆◆785.63±39.78△☆◆797.46±42.46△☆720.55±49.34△☆834.28±25.29△☆◆811.15±33.81△☆

注：與同一時間點正常對照組比較，△P<0.05；與同一時間點模型組比較，☆P<0.05；與40 d模型組比較，▲P<0.05；與40 d干預組比較,◆P<0.05。

2.5 各組家兔頸部外周(頸后肌組織與血漿)中5-HT含量比較 如表4所示，組間比較中，與正常對照組兔外周5-HT含量相比，同期三個觀察點處模型組頸后肌組織5-HT含量升高(P<0.05)，第40天、60天時，模型組血漿5-HT含量升高(P<0.05)；與模型組外周5-HT含量相比，同期三個觀察點處，干預組5-HT含量降低(P<0.05)。組內比較中，與模型組第40天外周5-HT含量相比，第20天時頸后肌組織5-HT含量降低(P<0.05)，第60天時血漿中5-HT含量升高(P<0.05)。與干預組第40天外周5-HT含量相比，在第20天頸后肌組織5-HT含量升高(P<0.05)。

表4 各組家兔頸后肌組織及血漿內5-HT含量比較

3 討論

慢性靜力性損傷是一種長期逐漸積累的細微損傷，國外學者[11]主要通過物理治療配合藥物治療來緩解局部疼痛不適，物理療法主要依據肌膜學、人體力學、人體解剖學理論進行治療。理筋手法是國外損傷醫學與中醫學肌膜理論的高度融合形成的專門針對筋傷類疾病的治療方法，針對性強，臨床療效顯著。課題組在長期的臨床實踐中發現理筋手法在治療頸椎病中能夠明顯緩解疼痛、提高人們的生活質量,能夠治療頸部筋傷，明顯減輕頸部酸痛不適，改善患者頸部活動度(總治愈率>90%)[12]。本實驗通過建立家兔頸后肌慢性靜力性損傷模型，采用理筋手法進行，通過觀察中樞(脊髓、下丘腦)中β-EP、ENK和外周(頸后肌組織、血漿)中β-EP、5-HT含量的變化，探討采用理筋手法干預對慢性靜力性損傷的鎮痛效應。實驗通過一般形態學觀察可觀察到干預組第40天時肌原纖維紊亂、扭曲程度較模型組有明顯改善，說明理筋手法在損傷中早期時就進行干預，能夠減輕肌纖維的扭曲、變形，減緩炎性細胞浸潤的速度，從而縮短骨骼肌靜力性損傷后的修復時間。

β-EP亦稱安多芬或腦內啡，是一種內成性(腦下垂體分泌)的類嗎啡生物化學合成物激素。β-EP是存在于體內鎮痛作用最重要的內源性阿片肽，主要作用于β受體而產生鎮痛作用。由于β-EP肽鏈不易受酶裂解，故較其他種類內源性阿片肽增多了與受體結合的結構，因此鎮痛作用強而持久。陳艷偉[13]研究發現，手法鎮痛是刺激施術部位局部肌肉內β-EP的含量增加而達到鎮痛的效果。尚坤等[14]通過背部推拿療法有效促進β-EP 在體內的合成、分泌與分布，從而發揮其預防疾病、保健身體的作用。本次實驗研究發現，經理筋手法干預后，理筋手法干預組的β-EP含量均有不同程度的升高，說明理筋手法能夠通過調控β-EP含量的表達發揮鎮痛作用；其中與模型組第40天脊髓β-EP含量相比，干預組第40天脊髓β-EP含量顯著升高，說明理筋手法在干預中期能夠通過合成或釋放脊髓中β-EP物質，而產生鎮痛作用。在干預組中期下丘腦中β-EP含量與模型組相比有所下降，可能是由于局部炎癥刺激所導致。與模型組相比，干預組早中晚三期外周(軟組織、血漿)中β-EP含量均有顯著差異(P<0.05)；說明理筋手法干預能夠激活內源性鎮痛物質，促進β-EP的升高，抑制痛覺信號的釋放和傳遞，實現鎮痛作用。

ENK又稱腦啡肽，是一種內源性阿片肽類物質，是中樞系統中主要參與機體內疼痛反應調節的主要內源性鎮痛物質。ENK在脊髓中釋放能夠抑制傷害性P物質的釋放[15]。實驗發現，干預組、模型組ENK的含量均降低，可能是慢性靜力性損傷導致的積累性損傷產生痛覺過敏，導致疼痛持續時間長，使表達量均有降低。但是經理筋手法干預后，中早期干預組ENK的含量均顯著升高；晚期下丘腦ENK的含量降低；理筋手法干預40 d較干預60 d ENK的含量有所降低；說明在中期理筋手法干預能夠促進中樞內源性阿片肽類物質的釋放，鎮痛作用明顯。晚期下丘腦ENK的含量降低可能是由于在干預晚期ENK上行與內源性阿片肽β-EP共同作用使下丘腦中ENK含量降低，共同抑制致痛性物質釋放，從而達到減輕疼痛的目的。

5-HT又稱為血清素(Serotonin)，它既是一種單胺類神經遞質，也是一種血管活性物質。5-HT作為目前已知的神經遞質之一，在中樞和外周中均有分布，但是由于分布位置不同所以對疼痛的刺激性大不相同。其中外周5-HT主要由胃腸道的APUD細胞產生，釋放入血，由血小板提取并儲存在體內，在一定條件下釋放入血，有較強的收縮血管與平滑肌的作用，還能夠促進凝血，增加血管內膜通透性。同時外周5-HT受體能夠形成下行的調控網絡參與疼痛信號的傳導，在外周的局部能夠起到誘發甚至加重疼痛的作用[16]。本次實驗發現，同期三個觀察點處，模型組5-HT含量均升高，說明外周5-HT在痛覺傳輸中能夠發揮重要的致痛作用；同時實驗發現，在造模40 d時，模型組5-HT含量高于正常對照組5-HT含量、干預組。說明經理筋手法干預后能夠降低外周5-HT的合成釋放，減少激活神經末梢受體產生疼痛刺激。并且中早期就進行理筋手法干預，降低5-HT的合成和釋放的效果顯著。在與前期課題組研究[17]中發現外周血中游離的5-HT 是強烈的致痛物質，當機體受到傷害刺激時，游離的5-HT含量升高，引起疼痛刺激效應的結論一致，再次印證了降低外周血漿中5-HT含量對降低疼痛刺激的重要性。

綜上所述，理筋手法可通過升高中樞(脊髓、下丘腦)β-EP、ENK、外周(頸后肌組織、血漿中)β-EP的表達量，降低外周(頸后肌組織、血漿中)5-HT的表達量，參與中樞、外周的鎮痛過程。但是其中影響疼痛遞質的具體調控機制尚不明確，后期還將對這一問題進行進一步深入研究。