馬齒莧多糖對LPS誘導小鼠急性肺損傷的實驗研究

黃小強 祝丹江 王魯豫 陳雨田 孫嘉寧 黃 濤 賈 安

黃河科技學院醫學院，河南 鄭州 450063

急性肺損傷(Acute lung injury，ALI)是急診科室中最常見的危重病之一，它的特點是肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷，造成彌漫性肺間質及肺泡水腫，同時伴隨蛋白質的滲出、大量炎癥介質及因子的釋放[1]。炎癥細胞因子和相關介質伴隨ALI的發生與發展全過程，例如TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS和NO等[2]。ALI在臨床上具有較高的死亡率和發病率，其死亡率然高達40%～60%[3]。馬齒莧為馬齒莧科植物馬齒莧(PortulacaoleraceaL.)的干燥地上部分，全國絕大地區均有分布，中國藥典(2020版)記載具有清熱解毒、涼血止血、止痢的功效[4]；由于富含多種營養成分，其中以維生素及ω-3脂肪酸最為突出，因此馬齒莧也是一種營養價值較高的食物[5]。國內外學者研究[6-8]發現馬齒莧的主要化學成分包括：多糖類、黃酮類、生物堿類、有機酚酸類等，同時藥理學研究[9-12]發現，馬齒莧多糖具有一定程度地降低炎癥因子和護肝等作用。為了探討馬齒莧多糖是否對ALI的保護作用，本研究應用馬齒莧多糖對LPS誘導ALI小鼠模型開展相關研究。為馬齒莧今后進一步深入開發和臨床應用提供一定參考。

1 材料與儀器

1.1 試藥 馬齒莧(張仲景大藥房)；脂多糖(美國Sigma公司)；醋酸地塞米松片(遂成藥業股份有限公司)；腫瘤壞死因子ɑ(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)和白介素6(IL-6)ELISA檢測試劑盒(上海西塘生物科技有限公司)；髓過氧化物酶(MPO)活性檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 動物 60只清潔級KM雄性小鼠，體重18～20 g，由黃河科技學院醫學院實驗動物中心提供，動物房光照條件12 h/d，溫度20～23 ℃，相對濕度40%～60%，小鼠適應性飼養7 d后用于實驗。

1.3 儀器 多功能酶標儀(奧地利，Infinite公司)；高速臺式冷凍離心機(美國，賽默飛世爾科技有限公司)；FY135型中草藥粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；DHP-9052電熱恒溫培養箱(上海-恒科技有限公司)；BS-3000A系列電子天平(上海友聲衡器有限公司)；光學顯微鏡(日本，OLYMPUS)；RM2125型石蠟切片機(德國，Leica公司)。

2 方法

2.1 藥物制備

2.1.1 馬齒莧多糖的制備[13-14]將馬齒莧粗粉，過10目篩，稱取500 g，加入4倍量無水乙醇浸泡24 h，抽濾，60 ℃烘干藥渣，然后加入10倍量的蒸餾水，置于80 ℃水浴鍋中溫浸2 h，溫浸提取2次，合并2次濾液，利用旋轉蒸發儀減壓濃縮至200 mL，然后加入800 mL無水乙醇至80%，劇烈搖勻，4 ℃低溫靜置分層，抽濾，收集沉淀，即為馬齒莧粗多糖。沉淀完全溶于蒸餾水后加入適量活性炭進行脫色，抽濾，再加入少量Sevage試劑，充分震蕩，靜置分層，收集上清液，減壓濃縮，并真空冷凍干燥，得馬齒莧多糖，-20 ℃低溫保存備用。采用硫酸-苯酚法對馬齒莧多糖含量進行測定[15]，其工作曲線為C=3.6311A+0.0023，R2=0.9991，測定馬齒莧多糖含量為62.22%

2.1.2 醋酸地塞米松溶液的制備 取適量將醋酸地塞米松片置于研缽中，充分研磨，用生理鹽水配制成濃度為0.0005 g/mL的溶液，備用。

2.2 分組、造模與給藥 將60只清潔級KM小鼠適應性飼養7 d后，隨機分為6組：正常組，LPS型組，醋酸地塞米松組(0.005 g/kg·d)，馬齒莧多糖低、中、高劑量組(1.5、3、6 g/kg/d，生藥材)，每組10只，按10 mL/kg體重灌胃給藥，每天給藥1次，連續給藥14 d，除正常組和LPS組小鼠給予等量常溫生理鹽水，其他各組給予相應體積的藥物。末次給藥后2 h，采用鼻腔滴注法慢慢滴注LPS生理鹽水溶液(0.5 mL/kg)，正常組按照相同的方法給予相應體積的生理鹽水[16]。建立模型[17]后小鼠禁食不禁水12 h，采用眼眶取血，隨后脫臼處死，并迅速取出肺組織，備用。

2.3 肺組織W/D值計算[18]取小鼠右肺上葉，剔除肺組織上面結締組織，同時利用濾紙吸盡組織表面水分和血液，并稱量記錄為肺組織濕重；隨后將肺組織放置于溫度為80 ℃干燥箱中連續干燥48 h后，稱量記錄為肺組織干重，計算(W/D)。

2.4 肺組織中MPO活性測定 取適量小鼠肺組織置于組織勻漿器中，按試劑盒說明書操作制備成5%的肺組織勻漿液，并檢測MPO活性。

2.5 血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量測定 取血后，在低溫條件下4000 r/min離心10 min分離血清，取上清；按照試劑盒說明書步驟，采用酶聯免疫吸附劑法測定各組血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。

2.6 肺組織病理學檢查 切下右肺組織下葉經4%多聚甲醛溶液固定24 h后，用蒸餾水沖洗至無多聚甲醛味；然后進行常規的石蠟包埋，切片厚度5 μm。進行切片脫蠟、蘇木素-伊紅染色、封片。在光學顯微鏡下進行病理學觀察分析，根據肺泡壁厚度、肺組織破壞和炎癥細胞浸潤情況進行評分[19]。評分標準：0分=最小損傷；1分=輕度損傷；2分=中度損傷；3分=重度損傷；4分=最大損傷。肺損傷評分為3個指標評得分之總和。

3 結果

3.1 馬齒莧多糖對肺組織W/D值的影響 與正常組比較，LPS組小鼠肺組織W/B值顯著性升高(P<0.01)。與LPS組比較，經過馬齒莧多糖干預后各劑量組小鼠W/B值均有不同程度降低，其中中劑量和高劑量組均具有統計學差異(P<0.05或0.01)。見表1。

3.2 馬齒莧多糖對肺組織中MPO活性的影響 與正常組比較，LPS組小鼠肺組織中MPO活性顯著性升高(P<0.01)。與LPS組比較，經過馬齒莧多糖干預后各劑量組小鼠MPO活性均有不同程度降低，其中中劑量和高劑量組均具有統計學差異(P<0.05或<0.01)。見表2。

3.3 馬齒莧多糖對血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量影響 與正常組比較，LPS組小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量均顯著性升高(P<0.01)。與LPS組比較，經過馬齒莧多糖干預后各劑量組小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量均有不同程度降低，其中中劑量和高劑量組均具有統計學差異(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表1 各組小鼠肺組織W/D值的比較

表2 各組小鼠肺組織中MPO活性的比較

表3 各組小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β含量的比較

3.4 馬齒莧多糖對肺組織病理形態學的影響 正常組小鼠肺組織的結構清晰、無滲出液，同時也沒有出現水腫及炎細胞浸潤等現象。LPS組小鼠的肺組織出現明顯的炎性浸潤，肺泡間隔增厚及間質水腫等較為嚴重的病理損傷現象，與正常組比較，LPS組小鼠肺損傷評分顯著性升高(P<0.01)。與LPS組比較，經過馬齒莧多糖干預后各劑量組小鼠肺組織損傷均有不同程度的改善，同時肺損傷評分也有不同程度降低。如圖1所示。

圖1 各組小鼠肺組織病理形態學的變化圖(×20) 注：與正常組比較，##P<0.01；與LPS組比較，*P<0.05,**P<0.01。

4 討論

該研究通過鼻腔滴注LPS溶液建立ALI小鼠動物模型。在滴注LPS后2～4 h內可誘發ALI，在24～48 h內便可造成最大肺損傷[20]，該種方法可有效避免由于皮下注射LPS溶液引起的全身炎癥反應和臟器官衰竭[21]。革蘭陰性菌感染導致的肺炎是ALI最常見的誘導因素之一，由于LPS刺激巨噬細胞，從而導致機體大量釋放TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子，進一步引發急性炎癥反應[22]。目前國內外關于ALI的致病機制尚不明確，有學者[23]認為，ALI發生的主要原因是體內促炎和抗炎系統失衡。研究結果發現馬齒莧多糖能夠顯著性降低TNF-α、IL-1β和IL-6炎癥細胞含量，提示馬齒莧多糖對LPS誘導的ALI作用與其抑制炎癥因子分泌有關。

肺組織的W/D值大小在一定程度上反映了水腫的程度[24]，肺水腫程度與W/D值密切相關，W/D值越大則肺水腫程度越大，研究結果發現馬齒莧多糖能夠顯著降低W/D值，從而緩解LPS所誘導的ALI。肺組織病理學觀察發現LPS組小鼠肺組織損傷嚴重，通過馬齒莧多糖干預后上述病理變化明顯得到減輕。

綜上，本研究結果顯示：馬齒莧多糖能夠降低肺組織W/D值和肺組織中MPO活性，同時降低血清中TNF-α、IL-1β和IL-6炎癥因子含量，提示馬齒莧多糖對LPS所致的ALI具有一定的保護作用，其作用機制與抑制炎癥因子分泌有關。