娘母良通過抑制焦亡改善阿爾茲海默癥小鼠的空間記憶能力

孟 恬 劉云寬 陳清華 李永華 賀永勝*

1.云南洛宇生物科技有限公司，云南 昆明 650000;2.云南中醫藥大學云南省傣醫藥與彝醫藥重點實驗室，云南 昆明 650500;3.云南奕華農業生物有些公司，云南 昆明 650500

阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease，AD)是一種進行性的神經退行性疾病，以記憶力下降、認知功能障礙、視覺空間損害、執行功能障礙、人格和行為改變等為臨床特征[1]。娘母良(Polygala crotalarioides，佤文：Nya Miex Tiang)為佤族民間稀有珍貴藥材。經考證及中科院鑒定(報告編號：KUN-2106-024)，其屬于遠志科遠志屬的西伯利亞遠志(拉丁學名：PolyaglasibiricaL.)。藥理研究[2]表明，西南遠志具有養心安神、抗疲勞、抗低溫、抗缺氧、提高機體應激能力，提高機體對不良環境的適應能力等活性。本文通過AD 轉基因鼠探索娘母良對AD的治療作用，并初步探討娘母良在AD模型中通過調節焦亡相關因子，對AD的治療作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 12月齡清潔級野生型C57B1/6J-Sv129 雌性小鼠[體質量(20±5)g]以及12月齡清潔級半合子3xTG(APPswe，TauP301L和PS1M146V+/)雌性小鼠[體質量(20±5)g]購于美國杰克森實驗室(JAX，美國緬因州)；娘母良(Polygala crotalarioides)新鮮葉莖由云南奕華農業生物公司提供；Morris水迷宮：上海欣軟研制；Aβ40、Aβ42Elisa 試劑盒購于酶聯生物；Tunel熒光試劑盒購自博士德。

1.2 動物分組 將清潔級野生型C57B1/6J-Sv129 雌性小鼠分為對照組(n=12)，清潔級半合子3xTG雌性小鼠隨機分為3組(n=12)：模型組，陽性對照組，娘母良組。對照組：C57B1/6J-Sv129小鼠連續24周進行生理鹽水灌胃。模型組：3xTG雌性小鼠連續24周進行生理鹽水灌胃。陽性對照組：Huperzine A粉末溶解于蒸餾水中，加入40 %體積的0.1 M鹽酸5 mg/mL作為儲備液，給藥前用蒸餾水稀釋，每天以0.1 mg/kg灌胃給藥。娘母良組：從雙江縣(中國云南；地理空間坐標：99.844°E，23.514°N；海拔：1015.9 m)收集Polygala crotalarioides的新鮮葉莖，干燥后研磨成粉末備用，給藥前使用羧甲基纖維素鈉制備懸液，每天以 5 mg/kg 灌胃給藥，連續24周[實驗動物使用許可證號：SYXK(滇)K2021-0003]。末次給藥次日進行Morris水迷宮實驗，行為學檢測后一周對動物進行脫頸處死，快速取腦組織。

1.3 Morris 水迷宮實驗 Morris水迷宮實驗用于評估動物的空間學習和記憶能力[3]。實驗主要分為定位巡航實驗以及空間探索實驗兩部分。首先進行水迷宮適應性實驗。將小鼠隨機從盛水的圓形水槽迷宮(直徑100 cm，深60 cm，平均劃分為東北，西北，東南，西南四個象限并做好定位標記)輕放入水中，記錄動物找到水下平臺的時間，若超過60 s 則引導動物尋找平臺。讓動物在平臺上停留10 s。連續訓練7 d，每天2次，選游泳能力好，能自主找到平臺的動物進行后續實驗。定位航行實驗中，將動物隨機按四個象限輕輕放入水中，將動物每次自入水直至找到目標象限平臺并爬上平臺的時間記錄為逃避潛伏期(s)。正式試驗第6天進行空間探索實驗。實驗前將平臺撤走，隨機選一個入水點將樹鼩放入水中，記錄到達隱藏平臺的軌跡、總路程(mm)、總時間(s)。

1.4 ELISA檢測Aβ40和Aβ42沉積 取適量小鼠海馬區組織，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測其中Aβ40和Aβ42的濃度。將組織充分研磨制成組織勻漿，4 ℃，100,000g離心60min，取上清液根據ELISA試劑盒的說明進行檢測。

1.5 TUNEL染色實驗 腦組織切片脫蠟處理后一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒避光37 ℃下孵育TUNEL染液1 h，熒光Ⅱ抗 Alexa Flour 488 避光室溫下復染1 h，DAPI染液孵育5 min，抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下成像。

1.6 Western blot 分離各組小鼠海馬組織，使用RIPA 法對組織進行裂解。根據試劑盒說明使用BCA法測定蛋白濃度，蛋白變性后轉膜至PVDF膜，5%的脫脂奶粉在室溫下將膜封閉2 h后將表1中所示的一抗4 ℃下孵育過夜，二抗在室溫下孵育1 h。使用ECL化學發光法顯影，并通過ImageJ進行捕獲。使用NIH Image J軟件分析各條帶的光密度。

表1 抗體信息

1.7 統計學方法 通過GraphPad Prism 5.0 軟件(GraphPad Software, San Diego, CA)進行統計分析，正態分布的連續性變量均以平均數加減標準差(mean±SD)表示。組間比較采用t檢測,多組間比較采用單因素方差分析。在圖中以連線表示比較的組別，P<0.05為差異有統計學意義。

A.到達隱藏平臺的軌跡；B.逃避潛伏期；C.總路程；D.總時間圖1 娘母良改善AD模型小鼠空間學習和記憶能力圖注：*P<0.05,**P<0.01,****P<0.0001

2 結果

2.1 娘母良改善AD模型鼠空間學習和記憶能力 模型建立成功后，首先對各組小鼠進行Morris 水迷宮實驗。如圖1B所示，各組小鼠的逃避潛伏期隨學習天數的增加而逐漸降低。相比于對照組，模型組的逃避潛伏期明顯升高(P<0.0001)，且隨學習天數的增加變化不明顯，而娘母良組與陽性對照組小鼠的逃避潛伏期較模型組有明顯下降，且隨學習天數的增加而明顯降低(娘母良組：P<0.05，陽性對照組：P<0.01)。行為學實驗第六天進行的空間探索實驗結果顯示，相較于對照組，模型組到達隱藏平臺的軌跡更為復雜冗長，而娘母良組與陽性對照組小鼠的軌跡明顯有簡化的跡象(圖1A)。同樣，如圖1C-D所示，相較于對照組，模型組小鼠的總路程以及總時間均明顯較高(P<0.0001)。娘母良組與陽性對照組小鼠總路程、總時間均有明顯下降(P<0.01)。結果說明，娘母良有改善AD模型鼠空間學習和記憶能力的潛力。

2.2 娘母良改善AD模型鼠海馬區神經細胞的凋亡 接下來，通過TUNEL 染色來驗證各組小鼠模型神經細胞的凋亡。如圖2所示，相對于對照組，模型組小鼠模型神經細胞的凋亡更為明顯，而娘母良組與陽性對照組小鼠的神經細胞的凋亡有明顯的改善。結果說明，娘母良對AD模型鼠的神經細胞的凋亡具有改善的作用。

圖2 娘母良改善AD模型鼠神經細胞的凋亡圖

A.Aβ40濃度；B.Aβ42濃度圖3 娘母良改善AD模型小鼠Aβ40和Aβ42沉積圖注：**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001

2.3 娘母良改善AD模型鼠Aβ40和Aβ42沉積 通過Elisa來檢測各組小鼠模型海馬組織Aβ40和Aβ42濃度。如圖3A，B所示，相對于對照組，模型組小鼠模型海馬組織Aβ40和Aβ42濃度明顯上升，而娘母良組與陽性對照組中小鼠的海馬組織Aβ40和Aβ42濃度均明顯下降。結果說明，娘母良對AD模型鼠海馬組織Aβ40和Aβ42沉積具有改善的作用。

2.4 娘母良改善AD模型小鼠Tau蛋白異常磷酸化 Tau 蛋白以及磷酸化Tau蛋白的蛋白表達量通過western blot進行檢測，并計算各組Tau蛋白磷酸化以及Tau總蛋白含量的比值(p-Tau/Tau)。如圖4所示，相對于對照組，模型組小鼠模型海馬組織中Tau蛋白磷酸化以及Tau總蛋白含量的比值(p-Tau/Tau)明顯上升，而娘母良組與陽性對照小鼠的海馬組織p-Tau/Tau均明顯下降。結果說明，娘母良對AD模型鼠海馬組織Tau蛋白的異常磷酸化具有改善的作用。

圖4 娘母良改善AD模型小鼠Tau蛋白異常磷酸化圖注：****P<0.0001

2.5 娘母良影響AD模型鼠焦亡因子表達 為了進一步研究娘母良對AD的作用機制，筆者通過western blot 檢測了焦亡因子caspase1(p20)以及GSDMD-N的相對蛋白表達。如圖5所示，相對于對照組，模型組小鼠模型海馬組織中caspase1(p20)以及GSDMD-N的相對蛋白表達較高，預示焦亡的發生。而娘母良組與陽性對照組小鼠的海馬組織caspase1(p20)以及GSDMD-N的相對蛋白均明顯下降。結果說明，娘母良可抑制AD模型中焦亡的發生。

圖5 娘母良影響AD模型鼠焦亡因子表達圖注：**P<0.01，****P<0.0001

3 討論

AD是一種進展緩慢的神經退行性疾病，始于輕度記憶喪失，最終導致嚴重的執行和認知功能障礙[4]。目前AD仍無法治愈，已有的抗AD藥物僅能夠延緩病理癥狀的加深，并不能有效阻止、逆轉疾病過程，并且停藥后易復發[5]。AD的機制涉及多種假說，主要包括β淀粉樣蛋白( β-amyloid，Aβ)毒性、Tau 蛋白異常磷酸化和聚集、突觸丟失、線粒體功能異常和氧化應激、胰島素抵抗、神經炎癥、血管內皮的損害等，但其具體發病機制仍然亟需探討[6]。娘母良屬遠志科遠志屬多年生草本植物，喜生長于海拔900～1500 m 的紅土向陽山丘，性溫，味甘，具有補腎助陽、養心安神、祛痰解痙的功效[7]。《神農本草經》中記載，遠志具有寧心安神的功效，治療心神不安、驚悸、失眠、健忘等證。《藥性論》中也有記載其“治健忘，安魂魄，令人不迷”[8]。宋代《圣濟總錄》中記載的遠志散，由遠志、石菖蒲、茯苓、人參、黃連5味藥物組成，有益氣化痰開竅、益智健腦的功效，可改善健忘、癡呆等記憶力減退病證[9]。同樣，一些學者通過現代日益發展的科學技術同樣證明了遠志對于AD的治療可能性[10-11]。本文的結果顯示，娘母良可通過減少神經細胞凋亡，改善Aβ40、Aβ42沉積以及Tau蛋白異常磷酸化來改善AD模型鼠的空間學習和記憶能力。

焦亡是一種由炎癥引起的程序性細胞死亡，主要由核苷酸結合寡聚化結構域NOD樣受體(NLRs)的炎癥體介導，并依賴于Caspase家族[12]。當發生焦亡時，炎癥小體介導包含Caspase-1在內的多種Caspase的激活，造成包括GSDMD在內的多種Gasdermin家族成員發生剪切和多聚化，細胞發生穿孔，進而腫脹，直至細胞膜破裂，導致細胞內容物的釋放，從而引發炎癥的進一步惡化[13-14]。根據激活機制，焦亡可以分為caspase-1依賴性和非caspase依賴性途徑[15]。這兩種途徑都是通過裂解Gasdermin-D(GSDMD)而激活的。GSDMD是焦亡的效應因子，因此可以釋放N端成孔結構域，插入質膜，造成細胞穿孔，誘導質膜破裂，釋放細胞內容物，包括白介素(IL)-1β和IL-18。近年來，焦亡在AD 疾病進程中的重要性吸引了越來越多人的關注。Shen 等[16]發現GSDMD在AD患者中的表達量增加，這可以作為診斷AD并區別于血管性癡呆的生物標志物。李澤等[13]證明喂食高脂飼料和APP/PS1基因均能加強小鼠腦內炎性反應，高脂飲食能夠進一步加重癡呆小鼠神經細胞焦亡和神經損傷。Cai 等[17]證明了紅景天苷在藥理學劑量下可通過抑制NLRP3炎癥體介導的焦亡改善AD的癥狀。本研究發現，娘母良可能抑制AD模型鼠中海馬體內焦亡因子的表達，預示著娘母良可抑制AD模型鼠海馬組織中神經細胞焦亡的發生。

綜上所述，本文驗證了娘母良對AD模型的治療作用以及作用機理，并初步探討了娘母良對神經細胞焦亡抑制的作用，為娘母良治療AD的機制研究提供了一定的實驗基礎。為了更升入的探討其機制，課題組將在接下來的研究中探討更加有效的原料藥的溶解方案，并進一步加大實驗樣本量和給藥途徑，研究藥物的最佳用藥劑量以及給藥方式，以期多角度探索佤藥娘母良的臨床及科學研究價值。