遼藁本配方顆料標準湯劑UPLC特征圖譜研究

王曉彤 張志強 高 揚 周永康 田聰慧

北京康仁堂藥業有限公司/北京市中藥配方顆粒工程技術研究中心，北京 101301

遼藁本為傘形科遼藁本LigusticumjeholenseNakai et Kitag.的干燥根莖和根，秋季莖葉枯萎或次春出苗時采挖，具有祛風、散寒、除濕、止痛的功效；主治風寒感冒、巔頂疼痛、風濕痹痛[1]， 始載于《神農本草經》，列為中品。主要分布于山西、山東、河北、遼寧、吉林[2]等地。

目前針對于遼藁本的研究集中在化學成分、藥理作用及科學種植等方面，尚未發現有遼藁本標準湯劑的相關研究。有學者[3]指出遼藁本揮發油的主要成分是水芹烯、醋酸松柏酯、肉豆蔻醚等。藁本、遼藁本所獲得的HPLC指紋圖譜大致相似，僅少數峰峰面積存在一定差異。在分子鑒定領域，有學者通過不同產地川芎及藁本、遼藁本的ITS2序列的比較發現，藁本、遼藁本GC含量、變異位點及遺傳距離均提示二者親緣關系近，極有可能是同一物種的兩個變種或者其中之一為另一個的變種[4]。林偉雄等[5]建立了遼藁本藥材的UPLC特征圖譜，比較了藥材與藥渣之間的區別，為藥渣的二次利用提供了一定依據。

中藥標準湯劑是由單味中藥飲片經水提、濃縮、干燥而成，被作為中藥配方顆粒的中間體，配方顆粒經中醫臨床配方后，供患者即沖即服，具有方便攜帶、便于調配等優點[6]。近年來，隨著市場份額的不斷擴大，迫切的需要統一質量標準。但由于加工為中間體標準湯劑后，外在的性狀、顯微特征消失，無法通過傳統鑒別方法確定基原，從而影響對其質量的全面控制。本研究采用UPLC法建立了遼藁本特征圖譜，不僅可以為遼藁本配方顆粒質量標準提供依據，還可以用于不同基原藥材的鑒別，具有快速、準確、專屬性強等特點。

1 材料

1.1 儀器 Waters ACQUITY UPLC?H-Class超高效液相色譜儀，PDA Detector檢測器，TUV Detector檢測器，Empower 3色譜工作站。ME104E電子天平(梅特勒·托利多)，JY20002電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)，KQ-500DB超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。微電腦陶瓷煎藥壺(永達基電器廠)； DZKW-4電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業儀器有限公司)；DHG-9245A電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；LGJ-10F冷凍干燥機(北京松源華興科技發展有限公司)；N-1100旋轉蒸發儀、CCA-1112冷卻水循環裝置、MZ2cNT氣動薄膜真空泵(日本東京理化器械株式會社)。

1.2 試藥 阿魏酸對照品(批號：110773-201614，純度99.0%，中國食品藥品檢定研究院)；藁本對照藥材(批號：121128-201202，中國食品藥品檢定研究院)；遼藁本對照藥材(批號：121129-201702，中國食品藥品檢定研究院)，乙腈(Merck)，磷酸(Fisher)，水(廣州屈臣氏)，其余試劑均為分析純。遼藁本藥材共15批，經北京康仁堂藥業有限公司于立偉經理鑒別為遼藁本LigusticumjeholenseNakai et Kitag.，研究人員自行加工為飲片，作為標準湯劑原料。藥材詳細信息見表1。

表1 遼藁本藥材樣品信息

2 方法與結果

2.1 標準湯劑制備 以衛生部、國家中醫藥管理局發布的《醫療機構中藥煎藥室管理規范》[7]和國家藥典委員會發布的《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求(征求意見稿)》[8]為依據，考察遼藁本標準湯劑工藝條件，以制備 “遼藁本標準湯劑”， “遼藁本標準湯劑”的制法為：取遼藁本飲片，置于砂鍋中，浸泡30 min，一煎加入飲片量10倍水，武火煮沸后，文火煎煮30 min，趁熱過濾，迅速冷卻，備用；二煎加飲片量8倍水，武火煮沸后，文火煎煮20 min，趁熱過濾，迅速冷卻備用；合并濾液，濃縮(50 ℃)，濃縮至料液比約為1∶1(相對密度為1.05～1.10(50 ℃)，冷凍干燥，即得。以上述方法制備15批次遼藁本標準湯劑。

2.2 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC?BEH Shield RP 18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫：0～7.5 min，5～23% A；7.5～12 min，23～100% A，記錄12 min色譜圖；檢測波長280 nm；柱溫30 ℃；流速0.4 mL/min；進樣量2 μL。

2.3 供試品溶液的制備 取遼藁本標準湯劑粉末(過三號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱重，超聲處理20 min，放冷，用70%甲醇補足減失的重量，過濾，取續濾液，0.2 μm微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.4 對照藥材溶液的制備 取遼藁本對照藥材2.5 g，加入18倍水，煮沸50 min，按照標準湯劑制備工藝制備，濾過，濾液減壓濃縮至干，置具塞錐形瓶中，加70%甲醇50mL，密塞，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)20 min，放冷，搖勻，濾過，取續濾液，作為對照藥材溶液。

2.5 對照品溶液的制備 取阿魏酸對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1毫升含0.1 mg的溶液，即得。

2.6 方法學考察

2.6.1 重復性實驗 取同一批遼藁本標準湯劑(批號：190116-113301-01)6份，按“2.2”項下方法制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，結果顯示各共有峰相對保留時間無明顯變化，RSD值為0.47%～1.00%，相對峰面積RSD值為1.70%～2.78%，表明該方法重復性良好。

2.6.2 中間精密度實驗 取同一批遼藁本標準湯劑(批號：190116-113301-01)6份，按“2.2”項下方法制備6份供試品溶液，使用另一臺waters UPLC H-Class儀器，按“2.1”項下色譜條件進行測定，結果顯示各共有峰相對保留時間無明顯變化，RSD值為0.06%～0.17%，相對峰面積RSD值為0.28%～1.35%，不同儀器間相對保留時間RSD值為0.32%～0.73%，相對峰面積RSD值為1.76%～8.02%，表明該方法中間精密度良好。

2.6.3 穩定性 精密吸取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h按“2.1”項下色譜條件進行測定，結果顯示各共有峰相對保留時間無明顯變化，RSD值為0.32%～1.25%，相對峰面積RSD值為1.12%～1.99%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.7 特征圖譜的建立與分析

2.7.1 特征峰指認 分別取“2.3”項下供試品溶液與“2.4”項下對照品溶液，按照“2.2”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，如圖1所示。將供試品色譜峰與對照品色譜峰的保留時間進行對比，確定供試品溶液中，3號峰為綠原酸，5號峰為阿魏酸。

圖1 特征峰指認圖譜

2.7.2 特征圖譜的建立 分別取15批遼藁本標準湯劑供試品，按照“2.2”色譜條件獲得其液相圖譜，如圖2所示，使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》(2012版本)，以S1液相圖譜為參照圖譜，按中位數計算，得出遼藁本配方顆粒對照圖譜，選擇6個分離度較好的色譜峰為特征峰，并進行特征峰的標識。

圖2 15批遼藁本標準湯劑UPLC堆疊圖

圖3 遼藁本標準湯劑標準圖譜

2.7.3 共有峰相對保留時間、相對峰面積的測定 根據對照品的可獲得性及各特征峰所推斷的物質在藥效方面的代表性，確定了阿魏酸為參照物，同時由于其保留時間及峰面積在特征圖譜中的情況，確定5號峰(阿魏酸)為參照峰，計算各特征峰與5號峰的相對保留時間和相對峰面積，對15批遼藁本標準湯劑凍干粉特征圖譜進行數據處理。其結果見表2和表3。

2.7.4 不同批次標準湯劑特征圖譜相似度分析 使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》(2012版本)，計算15批遼藁本標準湯劑特征圖譜與對照特征圖譜的相似度，其結果如下。15批遼藁本標準湯劑特征圖譜與對照特征圖譜的相似度為0.984～1.000，均高于0.98，表明圖譜的差異較小。見表4。

表2 15批遼藁本標準湯劑相對保留時間表

表3 15批遼藁本標準湯劑相對峰面積

表4 相似度計算結果

續表4 表4 相似度計算結果

2.7.5 對照藥材圖譜 取遼藁本對照藥材溶液，在相同的色譜條件下進行測定，結果如圖4所示。由結果可知，樣品色譜圖與對照藥材對應良好。

圖4 對照藥材圖譜

3 討論

比較了不同波長(254 nm、280 nm、320 nm)，不同柱溫(25 ℃、30 ℃、35 ℃)，不同流速(0.38 mL/min、0.4 mL/min、0.42 mL/min)，不同流動相(乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.1%甲酸)的分離效果，結果以波長280 nm，柱溫30 ℃，流速0.4 mL/min，流動相為乙腈-0.1%磷酸時，分離效果較好。

比較了不同提取溶劑(乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇)，不同提取方式(超聲、回流)，不同提取時間(20 min、30 min、40 min)，最終確定以70%甲醇超聲提取20 min效果最好。

本研究獲得了15批遼藁本標準湯劑的特征圖譜，并進行了相似度計算，相似度結果均大于0.98，結果表明，不同產地的遼藁本藥材差異較小，整體一致，有較高的相似性，可以提供全面的質量信息。

遼藁本藥材一直以來都以野生、半野生為主，但由于早期中藥材的生產處于粗放型狀態，過度挖掘，對其生境的嚴重破壞，使大的自然居群越來越少。筆者通過走訪各大型藥材市場發現，目前市場上的藥材以遼藁本栽培品為主，質量以東北產為佳。遼藁本中的主要成分為苯肽類、揮發油類及酚酸類成分，作為標準湯劑使用時，由于經過高溫水煮，揮發油成分損失較大，此時以阿魏酸為主的酚酸類成分則為遼藁本中的主要成分。本法所使用的對照圖譜為對照藥材模擬標準湯劑制備后得到的特征圖譜，與標準湯劑保持高度一致性，對比分析更準確，專屬性更強,這對于遼藁本標準湯劑質量的有效控制及合理應用都具有一定的意義。