微生態制劑活菌的計數方法分析

蘇夢緣，伍新葉，朱 曦，王茜瑛，邵 嫄，李克克，梁運祥，李英俊

（1.華中農業大學生命科學技術學院，武漢 430070；2.河南金百合生物科技股份有限公司，河南 安陽 455000）

微生態制劑能夠調節和維持微生物生態平衡，在畜禽水產養殖中得到較為普遍的應用，可以改善環境、促進動物生長、改善畜禽水產品品質、提高飼料利用率，從而實現預防疾病、綠色健康養殖。活菌數為微生態制劑質量與安全性的重要考察指標，能夠直觀地展示微生態制劑質量，較高的活菌數可以一定程度反應微生態制劑的有效活性和保存的穩定性。微生態制劑活菌數的技術方法復雜多樣，對各種計數方法進行系統了解和對微生態制劑生產和應用進行分析均具有重要意義［1］。對平板培養法、直接染色觀察法、流式細胞術檢測法、MTT 計數法、MPN-PCR 檢測法、實時熒光定量法、ATP 生物發光法、Bactec 9120 血培養儀法、高通量生長曲線法、濾膜法（濃縮法）、顏色改變單位法（CCU）、LAMP 環介導等溫擴增法等12 種活菌計數法進行了系統介紹和優缺點分析與總結，為相關研究和應用提供參考。

1 常見活菌計數方法及其原理

1.1 平板培養法

平板培養法包括稀釋涂布平板法和稀釋倒平板法，兩者的區別在于，前者是將稀釋過后的待測樣品涂布于培養基上，后者是將稀釋后的待測樣品與培養基混勻后進行倒板。該方法計數準確性高，常作為其他計數方法的參照，在各個領域廣泛應用，同時也在不斷被優化和改良。例如，Takano 等［2］在強酸條件下使用瓊脂平板和結冷膠平板培養嗜酸性細菌，評估了兩種平板在酸性條件下細菌培養時間和菌落分離平板培養方法的極限范圍。平板培養法也存在一定局限性，比如對厭氧微生物進行計數就需要將平板置于嚴格的厭氧培養環境；同時，平板培養法依賴于微生物的生長，需要較長的培養時間，難以實現快速檢測。

1.2 直接染色觀察法

直接染色觀察法是通過細胞膜的完整性以及細胞代謝活性等來區分活菌和死菌。其原理為活菌細胞膜完整且代謝正常，不易與染料結合，呈現出無色；死菌細胞膜不完整且無代謝活性，易與染料結合，從而顯出顏色。細胞經染色后，利用顯微鏡觀察計數，便可區分活菌和死菌。常用的染料有錐蟲藍、臺盼藍、剛果紅、亞甲藍（美藍）等。其中，亞甲藍由于沒有毒性而被廣泛應用。亞甲藍在氧化狀態時呈現出藍色，還原態時呈無色。在進行活體染色時，亞甲藍染料可與活細胞代謝物中H+結合從而被還原，呈無色；死細胞因不進行代謝活動，脫氫酶失去活性，亞甲藍不能被還原，因此死細胞被染色且呈藍色或淡藍色。美藍染色法也存在一些不足，①細胞染色若較淺，會使判斷準確度降低。②染色時間或計數時間的長短會影響觀察染色效果，對結果的準確性造成影響。③細胞形態的異常會對檢測結果造成影響。

直接染色觀察法操作簡單，成本低，但需要使用顯微鏡觀察，計數工作量大、耗時長，對操作者有一定的技術要求，檢測準確度不穩定，不適合大規模檢測應用［3］。

1.3 流式細胞術檢測法

流式細胞術（Flow cytometry，FCM）屬于定量分析技術，核心儀器為流式細胞儀，可以同時對單個細胞的多項參數進行定量或定性分析。

利用FCM 對活菌進行計數的原理是，用特異性熒光信號對細胞進行標記，用流式細胞儀測定標記細胞，統計活菌個數。傳統的基于熒光信號的流式細胞術也存在局限，其檢測的目標參數較為單一，數據處理過程較為復雜。在進行多次技術改進后，已開發出了更多適用于細胞計數的流式細胞術，如定量流式細胞術、多色流式細胞術、磷酸化流式細胞術、流式微球分析技術、質譜流式細胞術、成像流式細胞術和體內流式細胞術等［4］。

該檢測法的優點在于檢測參數多，無需細胞培養過程，檢測速度快，最高可達每秒上萬個細胞，檢測結果精度高，準確性好等；缺點在于檢測儀器昂貴，檢測費用高，不同待檢菌株在靈敏度上存在差異，對于復雜樣品，需要進行預處理才能用于檢測。

FCM 在醫學診斷中具有較大的開發價值，可用于檢驗白血病患者的外周血白血病細胞［5］、研究外周血淋巴細胞DNA 受到鉛損傷的情況等［6］。

1.4 MTT 計數法

MTT 是一種噻唑鹽，化學名為3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽。MTT 計數法是Mosmann［7］提出的。MTT 水溶液為黃綠色，容易穿過細胞膜，與活細胞線粒體中的琥鉑酸脫氫酶進行反應，被還原成藍紫色不溶于水的甲瓚［8］。死細胞沒有代謝，脫氫酶無活性，沒有還原反應，MTT 顏色不發生變化。測定溶液的吸光度（OD555nm）或利用有機溶劑如二甲基亞砜（DMSO）溶解甲瓚再測定吸光度，則可測出活細胞數［9］。

MTT 法有快速、準確、工作量小、能區分活死細胞等優點，使用范圍較廣，多用于動物細胞活菌計數、細胞毒理試驗、微生物活菌計數等。但當活菌數較低或較高時，MTT 的反應產物會過低或過高，導致所測吸光度超出檢測范圍。因此MTT 檢測法不適用于濃度太低或太高的細菌液［10］。

1.5 MPN-PCR 檢測法

MPN-PCR 檢測法又稱最大可能數法，與稀釋平板檢測法有一定的聯系，但卻是間接與泊松分布相關的一種計數方法［11］。該方法一般是將待測樣品進行10 倍梯度稀釋，每個梯度設3 個平行，在適當條件培養后使用PCR 擴增計數進行測定。若樣品中含有目標菌，則依據觀察到的PCR 陽性管數，檢索MPN 表，得出樣品中目標菌的MPN 值，得出待測菌的數量，也叫九管法［12］。

1915 年Mc Crady 利用MPN 最大可能數法估算細菌濃度［13］。該方法適用于測定在混雜的微生物群中雖不占優勢，卻具有特殊功能的類群。例如檢測特殊的土壤微生物群、牛奶或食品中特殊微生物類群（如大腸桿菌）數量，還可進行污水檢測［14］。

1.6 實時熒光定量法

實時熒光定量法（Quantitative real-time PCR）的原理是基于標準PCR 技術，在擴增反應中加入熒光基團，使用能夠進行熱循環和熒光信號篩查的儀器，在每次循環后，對熒光信號進行檢測，進而得到靶核酸的含量，熒光信號和擴增片段的數量成正比。該種方法具有特異性高、靈敏度高、檢測周期短、能夠檢測活的但不可培養（VBNC）狀態下的細胞、自動化程度高等優點。缺點在于無法對死菌和活菌DNA 進行區分。

在檢測嗜肺軍團菌時，由于該菌能夠“隱藏”于變形蟲體內，且生長速度緩慢，不適合使用傳統的培養計數法進行計數，因此qPCR 檢測技術被認為是一種嗜肺軍團菌潛在風險量化方法［15，16］。此外，qPCR 技術還被用來度量不同紫外光照射后DNA 的損傷程度［17］。

疊氮溴化丙錠（PMA）是一種光敏性DNA 結合染料，自身熒光弱，具有高親和力，在結合核酸后，熒光信號會大幅度增強。在進行DNA 提取前，將待測樣品與PMA 混勻，PMA 會有選擇性地與膜損傷細胞中的雙鏈DNA 作用，嵌入其中。在464 nm 的可見光的作用下，PMA 分子中的疊氮基團分解，產生具有高活性的氮烯類化合物，和DNA 分子共價交聯產生沉淀，抑制qPCR 過程中膜損傷細胞DNA 的擴增。溶液中殘留的過量染料與水分子可在光照的條件下產生反應，生成羥胺化合物，使過量染料失去交聯活性，對后繼活細胞DNA 的擴增不存在影響。

PMA 的選擇滲透性和qPCR 的特異性相結合，能夠大幅度提高檢測速度和靈敏性［18］。龐貝妮等［19］依據PMA/EMA-qPCR 活菌檢測機理，對試驗的曝光時間和染料濃度等因素進行優化，確認EMA-qPCR檢測方法適合作為沙門氏菌活的一種初篩方法。在食品工業中，PMA/EMA-qPCR 和qPCR 等方法均有較廣泛的應用，在確定最佳PMA 濃度的情況下，用PMA-qPCR 檢測保加利亞乳桿菌sp1.1［20］、乳品中酵母菌［21］、牛奶中的蠟樣芽孢桿菌［22］等，EMA-qPCR檢測單核細胞增生李斯特氏菌［23］、丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種［24］、水樣中彎曲桿菌［25］等，能夠更好地對活細胞進行區分和計數。

影響PMA-qPCR 檢測效率的因素有微生物細胞膜結構差異、微生物待擴基因的選擇、PMA 濃度、暗反應時間和光反應條件。

1.7 ATP 生物發光法

三磷酸腺苷（ATP）是所有生命活動的能量載體，ATP 的含量在活菌中會保持在一定范圍內，若細菌死亡，則ATP 會被胞內酶在短時間內快速分解，所以可用ATP 的含量反映樣品中的活菌數。

ATP 生物發光法的原理是熒光素酶在Mg2+催化下使熒光素與ATP 反應形成熒光素-AMP 復合物，并產生焦磷酸（PPi）。當復合物被O2氧化后，會形成激發態復合物，并產生CO2，當激發態轉化成基態時會釋放能量而發光。在一定范圍內，發光強度與ATP 濃度呈線性關系，從而檢測活菌的數量［26］。

ATP 生物發光法簡便、快速、重現性好、可檢測出不可培養的微生物，但是要求樣品細菌濃度至少滿足1 000 CFU/mL，需要富集樣品菌落總數達到有效檢測范圍才能準確檢測，檢測靈敏性有待加強［27-29］。傳統的ATP 生物發光法測定的是總ATP，對活菌數檢測會造成誤差，鹽濃度也會影響檢測結果［30］。將ATP 生物發光法與免疫磁分離技術（IMS）相結合，可以濃縮分離樣品對微生物進行特異性識別，提高檢測靈敏性。該方法由Lee 等［31］應用到水中大腸桿菌含量的檢測。Cheng 等［32］研究了生物免疫納米磁微粒（BMNPs）技術與ATP 生物發光法的結合，該方法可檢測更多微生物，并降低檢測限。Hammes 等［33］對ATP 生物發光法進行了優化，大幅降低其檢測限（可達0.000 1 nmol/L），并將活菌ATP和胞外ATP 進行了區分。

1.8 Bactec 9120 血培養儀法

Bactec 9120 血培養系統進行活菌計數的原理為，微生物細胞在培養瓶中代謝產生的CO2會激活瓶底中的感應物質而產生熒光，熒光信號的強度和CO2的生成量成正比，將該熒光信號經過一定的計算，就可以對微生物的數量和生長情況進行判斷。該方法在臨床活菌計數中具有較大應用價值［34］。

1.9 高通量生長曲線法

高通量生長曲線法是在實時定量PCR 的擴增曲線原理的基礎上，根據微生物的指數生長曲線而建立的［35］。該方法在設置特定濁度后，根據細菌培養到達該濁度的時長進行活菌計數。使用微孔板進行培養，設置多個平行，對微生物進行高通量實時監測，進行活菌計數。高通量生長曲線法也適用于輔助檢驗消毒劑的殺菌抑菌作用，相比于MTT 比色法，高通量生長曲線法計數更加準確，并且其線性范圍更寬［36］。該方法無需特別試劑，不會被特殊試劑的缺乏所限制。缺點在于檢測過程較耗費時間，需要測定吸光度。在具備自動化儀器的情況下，操作會簡化，且測量精度和范圍將進一步優化［37］。

1.10 濾膜法（濃縮法）

該方法主要是通過微孔薄膜將待測樣品進行過濾富集，再把薄膜在培養基或浸有培養液的支持物表面上培養，通過菌落數計算樣品含菌數，適用于測定空氣、水等體積大而含菌低的樣品中的活菌數。

1.11 顏色改變單位法（CCU）

顏色改變單位法適用于用比濁法無法計數的微小微生物。以支原體為例，由于培養液完全澄清透明，無法用溶液濁度來進行菌體計數，所以采用菌體代謝活力的數據變化進行菌體計數。該方法主要步驟是把樣品進行10 倍梯度稀釋，在適宜溫度下培養，把顏色改變的最末一管作為待測樣品的CCU［38］。該計數方法的結果會比實際偏低，可以通過減小稀釋梯度來改善，但會加大工作量。該方法在醫學研究方面廣泛應用［39-41］，有待進一步對各種支原體的計數梯度進行研究，擴展其適用范圍。

1.12 LAMP 環介導等溫擴增法

2000 年，Notomi 等［42］報道了環介導等溫擴增法，該方法需要根據目的基因設計一對外引物和一對內引物，有時也需要2 個環引物，總共需要4 或6條引物，在Bst DNA 聚合酶的作用下對目的基因進行擴增，環引物的增加可以提高檢測效率，但容易出現假陽性，可以與其他技術聯用進行改善。

LAMP 環介導等溫擴增法與PCR 相比，不需要熱循環設備，是一種高效、特異性高的計數方法，應用范圍廣［43-45］，被應用于食品安全檢測［46］、人類疾病監 測［47，48］、動 植 物 疾 病 監 測［49］等 方 面。傳 統 的LAMP 環介導等溫擴增無法區分死菌和活菌，會造成假陽性。該技術與DNA 熒光染料PMA 聯合使用［50］，也可利用RNA 的不穩定性建立實時熒光RTLAMP 檢測方法［51］來區分死菌和活菌，避免假陽性。該方法有成本低，特異性高等優點，在實際中具有較大的應用潛力。

2 12 種檢測方法的比較

12 種活菌檢測方法的比較見表1。

表1 12 種活菌檢測方法的比較

3 討論

活菌數作為微生態制劑的重要指標，反映微生態制劑的質量和穩定性。隨著活菌計數方法和儀器的開發與優化，活菌計數越來越準確、高效和快速。在活菌計數中，平板培養法的應用較為廣泛，通常被用做其他計數方法的參照。但是，平板計數法耗費時間長，在指導工業發酵生產的應用中有所限制，而基于核酸檢測的PMA/EMA-qPCR 檢測法、環介導等溫擴增等方法由于耗時短、操作簡單等優點，具有較大的潛力，值得重點關注和研究。