CDKN2BAS基因多態(tài)性與川崎病的關聯(lián)性研究*

張 馳，申 琳，易 璐，胡 爽，莊曉琪，左袁博教，黃利華，李卓穎，楊作成

中南大學湘雅三醫(yī)院兒科，湖南長沙 410013

川崎病是一種急性、全身性的血管炎性疾病，也稱為皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征，病因不明，易發(fā)人群多為5歲以下的嬰幼兒[1]，少數(shù)嚴重者可引起冠狀動脈病變。目前，川崎病的發(fā)病機制尚不明確，多認為是人體受各種病原微生物侵襲造成的免疫損傷[2]。川崎病是兒童發(fā)生后天性心臟病的重要原因之一[3-5]。研究表明，長鏈非編碼RNA(lncRNA)可以通過多種方式參與基因調(diào)控來達到影響人體生長、發(fā)育、代謝及疾病的目的，而定位于INK4位點上的lncRNA則稱作CDKN2BAS。CDKN2BAS即編碼細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2B反義RNA，可以調(diào)控多種靶基因，在炎性反應、免疫疾病和心血管疾病等方面發(fā)揮著重要作用。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)CDKN2BAS基因及其多態(tài)性與冠心病、動脈粥樣硬化及2型糖尿病等疾病有關，但目前缺乏CDKN2BAS基因與川崎病發(fā)病關系的相關報道。本研究采用病例對照的方法來探討CDKN2BAS基因rs1333049位點及rs4977574位點基因多態(tài)性與川崎病發(fā)病及合并冠狀動脈損傷(CAL)的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 按照川崎病的診斷標準，選擇2016—2019年本院收治的漢族川崎病患兒100例納入研究組，所有患兒入院前無阿司匹林和丙種球蛋白(IVIG)用藥史。根據(jù)美國心臟協(xié)會定義的冠狀動脈擴張Z值大小及心臟彩色多普勒超聲檢查結(jié)果，計算Z值[1]，將Z值<2的患兒納入川崎病無冠狀動脈損傷組(KD-NCAL組)，Z值≥2的患兒納入川崎病合并冠狀動脈損傷組(KD-CAL組)。KD-CAL組25例，KD-NCAL組75例。研究組中男58例，女42例，比例為1.38∶1.00；平均年齡(34.17±24.2)個月。另外選擇同期本院體檢健康嬰幼兒100例納入對照組，既往無川崎病病史，排除風濕性疾病、心血管疾病及感染性疾病等。對照組中男49例，女51例，男女比例為0.96∶1.00，平均年齡(42.38±28.3)個月。對照組與研究組性別比例比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1標本采集 在征得研究對象監(jiān)護人同意后，用含乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)的一次性采血管采集所有研究對象2 mL靜脈血，置于—80 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.2基因組DNA提取 取靜脈血標本，應用 Promega DNA提取試劑盒，按說明書要求提取DNA，用 NanoDrop ND-2000C 50分光光度計進行純度和濃度的檢測，存于—80 ℃的冰箱中備用。

1.2.3多態(tài)性檢測 采用聚合酶鏈反應-直接測序法(PCR-SBT)檢測CDKN2BAS基因多態(tài)性，通過GenBank檢索到CDKN2BAS基因序列，引物由鉑尚生物技術(上海)有限公司合成：rs1333049上游引物為 5′-CTTGAGACTAGTATACCAATCATACTCCT-3′，下游引物為5′-TACATATGTGTTAATGACA-3′；rs4977574上游引物為5′-CATGCTTTCTGAAACAACACG-3′，下游引物為5′-TAATGGAGGTGTGGTCAGCA-3′。PCR反應體系為15.0 μL，包括制好的模板DNA 1.0 μL，Taq DNA 聚合酶(MixⅡ) 9.0 μL，引物各0.5 μL，去離子水加至15.0 μL。rs1333049位點PCR擴增反應條件：(1)在 94 ℃下對樣品進行5 min的預變性1次；(2)按以下步驟進行35次循環(huán)，94 ℃下變性30 s，降至60 ℃退火30 s，溫度提升至72 ℃進行40 s延伸；(3)最后5 min延伸，4 ℃保存。rs4977574位點PCR擴增反應條件：(1)在 94 ℃下對樣品進行5 min的預變性1次；(2)按以下步驟進行35次循環(huán)，94 ℃下變性40 s，降至60 ℃退火40 s，溫度提升至72 ℃進行40 s延伸；(3)最后5 min延伸，4 ℃保存。對擴增產(chǎn)物染色后進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，可在紫外燈下照相后觀察結(jié)果并記錄電泳圖譜，初步判定擴增成功與否[6]。PCR 擴增產(chǎn)物送至鉑尚生物技術(上海)有限公司進行基因測序并用 Chromas軟件分析測序結(jié)果。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析，基因型和等位基因頻率以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。對研究組和對照組基因型及等位基因頻率進行Hardy-Weinberg遺傳平衡定律驗證，以確定兩組是否符合遺傳平衡。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1CDKN2BAS基因rs1333049位點及rs4977574位點多態(tài)性檢測 CDKN2BAS基因rs1333049位點PCR擴增片段大小為313 bp，rs4977574位點PCR擴增片段大小為411 bp，使用1%瓊脂糖凝膠電泳分離(圖1)。將 PCR 所得產(chǎn)物進行基因測序，顯示rs1333049位點存在CC、CG、GG 3種基因型(圖2)；rs4977574位點存在AA、AG、GG 3種基因型(圖3)。對研究組和對照組進行Hardy-Weinberg遺傳平衡定律驗證后，研究組與對照組CDKN2BAS基因rs1333049位點基因型頻率分布符合遺傳平衡定律(χ2=5.989，P>0.05；χ2=1.588，P>0.05)；研究組與對照組CDKN2BAS基因rs4977574位點基因型頻率分布符合遺傳平衡定律(χ2=0.430，P>0.05；χ2=0.745，P>0.05)。

注：A為 rs1333049位點；B為 rs4977574位點。

注：A為CC純合子； B為CG雜合子； C為GG純合子。

注：A為AA純合子； B為AG雜合子；C為GG純合子。

2.2CDKN2BAS基因位點多態(tài)性的變化

2.2.1川崎病患兒CDKN2BAS基因rs1333049位點多態(tài)性的變化 研究組與對照組CDKN2BAS基因rs1333049位點多態(tài)性C、G等位基因頻率和CC、CG、GG基因型頻率的分布比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。KD-CAL組與KD-NCAL組CDKN2BAS基因rs1333049位點多態(tài)性的C、G等位基因頻率和CC、CG、GG基因型頻率的分布比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表1 研究組和對照組CDKN2BAS基因rs1333049位點多態(tài)性的等位基因頻率與基因型分布比較[n(%)]

表2 KD-CAL組與KD-NCAL組CDKN2BAS基因rs1333049位點多態(tài)性的等位基因頻率與基因型分布比較[n(%)]

2.2.2川崎病患兒CDKN2BAS基因rs4977574位點多態(tài)性的變化 研究組與對照組CDKN2BAS基因rs4977574位點多態(tài)性A、G等位基因頻率和AA、AG、GG基因型頻率的分布比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。KD-CAL組與KD-NCAL組CDKN2BAS基因rs4977574位點多態(tài)性的A、G等位基因頻率和AA、AG、GG基因型頻率的分布比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。

表3 研究組與對照組CDKN2BAS基因rs4977574位點多態(tài)性的等位基因頻率與基因型分布比較[n(%)]

表4 KD-CAL組與KD-NCAL組CDKN2BAS基因rs4977574位點多態(tài)性的等位基因頻率與基因型分布比較[n(%)]

3 討 論

川崎病好發(fā)于亞裔嬰幼兒，發(fā)病年齡主要集中在6月齡至5歲[5]，可導致全身性中小血管炎癥。川崎病的并發(fā)癥主要是CAL，嚴重時甚至可導致冠狀動脈瘤發(fā)生。在早期未使用大劑量IVIG的情況下，每4例患兒中就有1例會發(fā)展為冠狀動脈瘤；而使用IVIG后，發(fā)病風險則降至4%左右[7]，但有10%～20%的患兒對IVIG不敏感[8]。川崎病的發(fā)病機制尚未完全明了，有研究發(fā)現(xiàn)，某些基因的SNP位點及其多態(tài)性與川崎病發(fā)病有關聯(lián)性，如白細胞介素(IL)-1β基因-31 T/C位點及PPIA基因rs17860041 A/C位點等基因的多態(tài)性與川崎病的發(fā)病存在相關[6,9]。

CDKN2BAS基因是位于人類染色體9p21區(qū)段上的CDKN2A/B基因叢轉(zhuǎn)錄的lncRNA，該基因定位于p15/CDKN2B-p16/CDKN2A-p14/ARF基因簇的INK4位點，全長126.3 kb，可沿蛋白質(zhì)編碼反義轉(zhuǎn)錄，形成長3 834 bp的mRNA。該基因通過不同轉(zhuǎn)錄剪接方式剪接形成約20種線性轉(zhuǎn)錄子及環(huán)形轉(zhuǎn)錄子，調(diào)控細胞增殖和凋亡[10-13]，從而參與多種疾病的發(fā)病，包括黑色素瘤、肝癌、鼻咽癌、膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤，以及動脈粥樣硬化、2型糖尿病等。在亞洲人群中，CDKN2BAS基因rs4977574位點攜帶G等位基因可能增加患冠心病、心肌梗死的風險[14]；rs1333040、rs1333049和rs2383207位點多態(tài)性與東亞人群冠心病的患病風險顯著相關[15]。CDKN2BAS基因rs1333049 C>G與急性心肌梗死患病風險顯著相關。同時CDKN2BAS基因rs2383207位點也與冠心病患病風險顯著相關[16]。另有研究發(fā)現(xiàn)，CDKN2BAS基因rs2184061位點AA基因型增加了45歲以上人群動脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)病風險，攜帶C等位基因則會明顯降低發(fā)病風險；同時，rs7044859位點的AA基因型同樣會增加45歲以上人群動脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)病風險[17]。一項膠質(zhì)瘤的研究發(fā)現(xiàn)，CDKN2BAS rs2151280 A>G與膠質(zhì)瘤發(fā)生風險升高有關，而rs1136410的GG基因型有利于無進展生存和整體生存，rs1136410 A>G和rs7763881 A>C更有利于膠質(zhì)瘤患者的整體生存[18]。一項關于胰腺癌的研究發(fā)現(xiàn)，攜帶rs1537373 TG/GG基因型的個體比攜帶TT基因型的個體表達更高水平的CDKN2BAS，從而賦予其胰腺癌的易感性[19]。研究發(fā)現(xiàn)CDKN2BAS在多種炎癥及免疫疾病發(fā)病過程中起到了重要的作用，如SONG等[20]對大鼠冠狀動脈粥樣硬化模型進行研究，發(fā)現(xiàn)環(huán)狀CDKN2BAS在加重血管內(nèi)皮細胞炎性反應方面起著重要作用，提示降低CDKN2BAS表達可能對動脈粥樣硬化患者的治療有保護作用。JARINOVA等[21]發(fā)現(xiàn)，CDKN2BAS基因可以調(diào)控下游內(nèi)皮細胞的炎性反應。這些研究提示CDKN2BAS基因可能在川崎病的發(fā)病過程中參與免疫炎性反應，導致川崎病血管炎的發(fā)生。但較少見CDKN2BAS基因多態(tài)性與川崎病關聯(lián)性的報道。

本研究對研究組與對照組，KD-CAL組與KD-NCAL組的CDKN2BAS基因rs1333049位點、rs4977574位點的等位基因頻率和基因型頻率進行比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示川崎病發(fā)病及合并CAL不受CDKN2BAS基因rs1333049位點、rs4977574位點的多態(tài)性影響。