基于生物阻抗譜的細胞懸浮液濃度識別方法研究*

劉圣龍 楊璐 朱程君 劉凱 韓偉 姚佳烽?

1) (南京航空航天大學機電學院，南京 210016)

2) (南京醫科大學第一附屬醫院腫瘤科，南京 210029)

3) (南京大學醫學院附屬口腔醫院，南京 210008)

基于生物阻抗譜技術提出一種細胞懸浮液濃度自動識別方法,該方法結合了多元線性回歸算法和生物阻抗譜技術,能夠快速準確地識別細胞懸浮液的濃度.首先,提出一種細胞位置隨機分布策略,模擬細胞的真實存在狀態;其次,采用數值仿真的方法生成2400組不同濃度的正常、癌變以及混合的細胞模型并計算生物阻抗譜數據;然后,利用多元線性回歸、支持向量機和梯度提升三種回歸算法分別對癌變細胞濃度進行鑒別,仿真結果表明,多元線性回歸算法為最佳回歸模型,其平均擬合優度和均方誤差分別是0.9997和0.0008;最后,將多元線性回歸算法應用于不同濃度的紅細胞懸浮液的識別中,實驗結果顯示其平均擬合優度和均方誤差分別是0.9998和0.0079,說明該方法具有較高的細胞懸浮液濃度識別能力.

1 引言

隨著現代醫學的不斷發展,醫學檢測方法已經進入細胞層次,其中細胞濃度在病情分析[1]、器官培養[2,3]、血型血清學試驗[4]以及腫瘤細胞黏附[5]等方面具有重要作用,已經引起許多研究者的關注.目前,一些成熟的細胞濃度檢測方法已經在臨床上應用,這些檢測方法各有優點,但同時存在不足之處.例如,免疫細胞化學法(immunocytochemistry,ICC)[6]可以準確地檢測細胞濃度,但檢測速度慢、操作復雜;多聚酶鏈反應法(polymerase chain reaction,PCR)[7]操作方便、靈敏度高,但其應用條件苛刻;流式細胞術(flow cytometry,FCM)[8]可以快速準確地檢測細胞濃度,但需要對被測細胞進行熒光標記.近些年,一些新的細胞濃度檢測方法被研究學者提出.2009 年Nilsson 等[9]提出了一種基于散斑效應的細胞濃度檢測方法,該方法可以在體外快速地檢測細胞濃度,并且可以觀察細胞的分布情況,但主要應用于紅細胞的檢測,并且易受到生理因素的干擾.2014 年Guo 等[10]利用光的折射率原理,設計了一款TFBG 折射率傳感器,該傳感器實現了對細胞濃度的高精度測量,但可以檢測的細胞濃度范圍有限,并且靈敏度較低.總之,現有的細胞濃度檢測技術都存在一定的局限性,為了進一步普及細胞濃度在醫學檢測方面上的應用,臨床上急需一種高精度、低成本且適用于連續監測的全新檢測方法.

生物阻抗譜(bioimpedance spectroscopy,BIS)技術是一種以多頻率、復阻抗為基礎的生理參數檢測技術[11].該技術利用一對或多對電極向被測物施加微小幅值的正弦電流或電壓激勵,通過采集被測物在各個頻率分量上的響應信號,經數字解調后得到被測物完整的響應頻譜.對測量得到的阻抗頻譜進行分析,可以獲取到諸如細胞尺寸大小、種類、存活狀態等豐富的生理化學信息[12].

由于BIS 采用非侵入式測量方法,無需使用熒光標記,并且可以反映細胞微觀尺度下的電學特性,被認為是未來最具潛力的疾病早期診斷手段之一[13].近些年來BIS 在腫瘤細胞早期診斷[14]、組織缺血監測[15]、乳腺癌淋巴水腫探測[16]等方面取得了很多有價值的研究成果.

此外,不同濃度的細胞溶液,其電學特性有明顯差異,BIS 可以從電學特性的差異性中提取有效的電信息,用來鑒別細胞的濃度.但是BIS 只能定性分析不同濃度的細胞溶液,不能準確對細胞樣本進行判斷.因此,為了定量檢測出細胞的濃度,考慮使用機器學習算法結合生物阻抗譜技術進行細胞濃度的準確檢測.

人工智能領域應用的機器學習算法在人臉識別[17,18]、自然語言處理[19]等領域都表現出良好的適應性.其中各種回歸算法也被廣泛應用到社會的各個場合.2016 年武漢大學劉泉聲等[20]將支持向量機回歸算法(support vector regression,SVR)應用到地應力場的反演中,并且反演得到的規律經驗證準確可靠.2017 年Keprate 等[21]利用梯度提升回歸算法(gradient boosting regressor,GBR)預測小口徑管道中裂紋擴展的應力強度因子,并且具有較高的預測精度和較少的計算時間.2020 年長安大學王征征等[22]運用主成分分析法(principal component analysis,PCA)和多元線性回歸算法(multiple linear regression,MLR)預測出生人口,極大地提高了出生人口的預測精度且具有一定的理論參考意義.

由于細胞在懸浮液中是隨機分布的,而細胞不同的位置會影響整體的電場分布特性,這會造成多次測量同一濃度細胞的懸浮液,其生物阻抗譜數據有較大波動,進一步地造成數據集樣本與對應標簽的混亂,最終大大地影響了分類算法的精度.通過建立合理的仿真模型,可以節省大量的時間成本;而目前急需利用一個模擬細胞隨機分布的方法,建立合理的仿真模型,使仿真生成與真實細胞存在狀態相似的生物阻抗譜數據集,繼而找到適合用于處理真實數據的回歸模型.

本文首先在數值仿真時,利用提出的細胞隨機分布策略,模擬細胞的真實分布,生成2400組不同濃度的正常、癌變以及混合的細胞模型并計算相應的生物阻抗譜數據;然后利用SVR,GBR和MLR三種回歸算法對仿真得到的數據集進行訓練,結果表明,MLR 是最優的回歸算法;最后在實驗中通過MLR 對不同濃度的紅細胞懸浮液進行訓練建模和定量分析,結果表明,該方法可以準確地識別細胞懸浮液濃度,可以為醫學檢測細胞濃度提供一種全新的方法.

2 仿真模型與方法

2.1 雙殼細胞仿真模型

免疫B 細胞是指在淋巴細胞中的抗體所形成的細胞前體,具有中和毒素、抗感染以及免疫調理等功能.免疫B 細胞是人體內具有代表性的免疫細胞,所以仿真對象選取人體免疫B 細胞來驗證本文提出的方法[23].如表1 所列,人體免疫B 細胞主要由細胞膜、細胞質、細胞核組成,細胞核又由核膜和核質組成,細胞膜的電導率為5.6×10—5S/m,相對介電常數為12.8,核膜的電導率為1.11×10—2S/m,相對介電常數為106.細胞懸浮液可等效為電阻和電容元件的組合[24],在低頻情況下,電阻成分發揮主要作用,由于細胞膜的導電性能低,因此,可阻止大部分電場線穿過細胞;而在高頻情況下,電容成分發揮主要作用,細胞膜的介電常數顯著下降,對電場線的屏蔽效應降低,但細胞核膜的介電常數較高,可阻止部分電場線穿過細胞核.為了研究不同種類、濃度的細胞懸浮液對阻抗譜的影響,建立了正常B 細胞和癌變B 細胞的仿真模型,如圖1 所示.仿真所用到的全部參數如表1 所列,仿真中設置電極兩端的激勵電流為1 mA,設置激勵頻率范圍為1 Hz—1 GHz.

表1 仿真參數匯總[23]Table 1.Summary of simulation parameters.

圖1 細胞仿真模型Fig.1.Cell simulation model.

2.2 細胞位置隨機分布策略

細胞濃度仿真需要在選定區域內進行大量的細胞建模,并且利用編程將繁雜的建模過程交給計算機自動完成,縮短仿真周期.其中仿真區域邊長設為L1=110 μm,然后將仿真區域均勻劃分為10×10 共 100 個網格,每個小網格的邊長為ls=11 μm,該網格可以同時兼容正常和癌變細胞的尺寸,以滿足兩種細胞混合仿真的需要.仿真區域所能容納的最大細胞數nmax=100,細胞濃度用仿真時的細胞數量nsim相對最大細胞數量的百分比?表示,即 ?=nsim/nmax×100%.

為了模擬真實細胞在懸浮液中的隨機分布情況,本文提出一種位置隨機分布策略.具體如下:MATLAB 具有庫函數randperm和reshape,randperm函數可以生成隨機打亂的數字序列,reshape 函數可以對矩陣的元素進行重新排列.因此利用randperm 函數生成了1—100 自然數的隨機數列,將生成模型的細胞濃度作為判斷閾值,隨機數列中小于該閾值的所有位置重新賦值為1,剩余位置賦值為0;然后通過函數reshape 將該隨機數列重塑為一個10×10 的矩陣,與仿真區域的網格對應,矩陣中數值為1 的位置對應的仿真區域進行細胞建模,數值為0 的位置則不進行任何操作.圖2 展示了?總=10%而?癌=3% 時的某次細胞位置隨機分布情況.

圖2 細胞位置隨機分布策略示意圖.藍色表示正常細胞,綠色表示癌變細胞Fig.2.Schematic diagram of random distribution strategy of cell location.Blue indicates normal cells,and green indicates cancerous cells.

2.3 數據集的準備與預處理

機器學習方法可以從人眼無法區分的相似特征數據集中尋找背后的規律,以便實現更為復雜的回歸鑒別工作.因此,本文選擇機器學習方法來實現不同細胞組濃度的識別,具體過程如下:

1) 正常細胞組:此仿真組中,仿真區域放置的全部為正常細胞,細胞個數1到 100 等間隔劃分為 100組,每組在位置隨機分布策略下仿真 12次,共得到 1200 條樣本;

2) 癌變細胞組:此仿真組中,仿真區域放置的全部為癌變細胞,細胞個數從 1到 10 等間隔劃分為 10組,每組在位置隨機分布策略下仿真 20次,共得到 200 條樣本;

3) 混合細胞組:此仿真組將兩種細胞按不同比例混合,細胞總數從 10到 100 等間隔劃分為10組,每組內部按癌變細胞個數從 1到 10 等間隔劃分為 10組,每個小組內部按位置隨機分布策略仿真 10次,共得到 1000 條樣本.

上述三個仿真組共得到 2400 個樣本數據,首先針對癌變細胞作出濃度劃分,然后作出癌變細胞濃度為 1% 時的 5次隨機位置的Nyquist圖,如圖3(a)所示,從圖中可以得知,相同濃度的癌變細胞,其位置的不同,會嚴重影響生物阻抗;最后作出其部分癌變細胞濃度的Nyquist圖,如圖3(b)所示,從圖中可以看出,其數據集存在比較嚴重的混雜,人眼無法識別.另外每個樣本數據有多個復阻抗值,若全部作為特征用于訓練,則會十分耗時,因此對多個復阻抗值進行系統抽樣;另外復阻抗值的實部和虛部反映待測物的電學特性(如電導率、相對介電常數)的比重不同,所以將復阻抗值的實部和虛部分離,并分別作為訓練特征.

圖3 部分濃度癌變細胞的Nyquist圖 (a) 癌變細胞濃度為 1% 時的 5次細胞隨機分布的Nyquist圖;(b) 不同癌變細胞濃度的Nyquist圖Fig.3.Nyquist plot of cancerous cells at partial concentrations:(a) Nyquist plots of randomly distributed cells at 5 times when the concentration of cancerous cells is 1%;(b)Nyquist plots of different cancerous cell concentrations.

2.4 基于機器學習的回歸模型

1)支持向量機回歸算法

支持向量機(support vector machine,SVM)的基本目的是在給定的特征空間中尋找一個最佳的分離超平面,使得兩類數據正確分離,并且間隔最大.SVM 還支持使用核函數Φ(x) 用來解決回歸問題,即SVR[25,26].SVM和SVR 的原理基本相同.其不同之處在于SVR 是回歸模型,沒有類別,其基本目的:讓訓練集中的每個樣本點 (xi,yi),盡量擬合到一個線性模型.SVR 算法適用了樣本容量小、非線性的問題,并且在引入松弛變量后,提高了模型的泛化能力.

2)梯度提升回歸算法

GBR 是一種集成學習算法,主要由損失函數、弱學習器和加法模型三部分組成[21].該算法的根本思想:通過多個弱學習器依次迭代并且擬合之前模型累加的損失函數的負梯度,總的損失函數朝著負梯度的方向減少.GBR 通過集成大量表現不好的學習算法,組成一個比較強大的學習算法,使其能夠同時處理多種類型的數據集、具有較高的預測能力,但是由于多個弱學習器必須串行處理,也導致其訓練速度過慢.

3)多元線性回歸算法

MLR 是研究某一因變量與兩個或兩個以上自變量之間的關系,是一種成熟的定量分析方法[27].因此多元線性擬合回歸方程可表示為

其中yi(i1,2,···m)為第i個樣本的標簽;xi,j(j1,2,···n)為第i個樣本的第j個特征;wj為對應特征的權重;b為偏置量.通常為了簡化表達式,將偏置量b歸納到向量w中,即有表達式:

則回歸模型可表示為

利用最小二乘法求得最優參數w,即確定了回歸模型.MLR 原理簡單、容易理解,建模速度很快,能夠得到明確的數學解,有利于決策分析;但是不適合對具有很強相關性的數據特征集建模.

2.5 基于回歸模型的仿真結果

利用2.4 節介紹三種回歸模型分別用于2.3 節仿真數據集的回歸建模,并且選擇一個最佳的回歸算法用于下文實驗數據的建模處理.事先對各個模型進行調參,使它們在最佳的狀態進行比較,并引入均方誤差(mean-square error,MSE)和擬合優度(R2)作為評價指標.將數據集按照 7∶3 的比例劃分成訓練集和測試集,用于上述三種回歸模型的訓練,得到的結果如圖4 所示.由圖4 可知,無論在訓練集還是在測試集中結果均為,MSEMLR＜ MSEGBR＜ MSESVR;說明MLR 是最佳的回歸模型.為了更形象地比較三種回歸模型的優劣,特地采用系統抽樣的方法選取80組數據,并比較三種回歸模型的預測值與真實值的接近程度,結果如圖5 所示,可以直觀地看出MLR 的預測值更接近真實值.

圖4 三種回歸模型對仿真數據集的訓練結果 (a) 訓練集的訓練結果;(b) 測試集的預測結果Fig.4.The training results of the three regression models on the simulation data set:(a) Training results of the training set;(b) predicted results on the test set.

圖5 三種回歸模型對部分數據預測值與真實值的差異 (a) 訓練集預測值與真實值的差異;(b) 測試集預測值與真實值的差異Fig.5.The difference between the predicted value and the true value of partial data by three regression models:(a) The difference between the predicted value of the training set and the true value;(b) the difference between the predicted value of the test set and the true value.

由圖4 可知,三種回歸模型的R2值十分接近,為了避免偶然誤差的影響,又通過五折交叉驗證求取平均值的方法,再次驗證阻抗譜數據集更適合哪種回歸模型.由表2 可知:五折交叉驗證的結果與之前調參后的結果基本一致,其中MLR 的結果十分穩定,平均擬合優度R2和均方誤差MSE 分別達到 0.9997和0.0008;而SVR和GBR 的結果有輕微波動,但其平均擬合優度R2和均方誤差MSE也分別達到0.9974,0.0302和0.9988,0.0150.本文選取的三種回歸算法表現都較為優異,SVR 適合非線性程度比較高的回歸問題,GBR 擅長于解決數據規律不明顯的回歸問題,可歸納總結大量樣本的潛在信息,而MLR 更適合解決線性回歸問題.在細胞濃度檢測這一問題上,MLR表現較好,說明本文所要解決的回歸問題更接近于線性回歸.因此將MLR 用于下文的實驗數據處理.

表2 仿真數據的三種回歸算法五折驗證結果Table 2.Validation results of three regression algorithms for simulation data.

3 實驗與驗證

3.1 實驗設備

本文分別用不同濃度的紅細胞懸浮液作為實驗對象.圖6(a)給出了實驗設備原理圖:一臺PC 機、一臺阻抗分析儀(IM3570)、一個屏蔽裝置和一個傳感器.圖6(b)是傳感器的結構圖,由一對平行的測量電極嵌入亞克力容器側面組成.測量電極長度dc=10 mm,高度hc=20 mm,極板間寬度wc=2 mm,單次測量可容納的細胞懸浮液體積V≈0.4 mL.將傳感器置于屏蔽裝置中進行測量,隔離周圍環境的電磁干擾,所述的屏蔽裝置是由鐵質容器構成并且需要接地,而且引入平均相對測量誤差s作為評價屏蔽性能的指標,其計算公式(4)式所示,使用屏蔽裝置后,連續兩次測量阻抗譜的平均相對測量誤差s為0.1%,不使用屏蔽裝置的平均相對測量誤差s為0.22%,s顯著降低.傳感器通過屏蔽線與阻抗分析儀進行連接;阻抗分析儀捕獲到探頭發出的信號后,將測量數據傳輸給PC 端進行處理.頻率測量范圍為f=1 kHz—5 MHz,測量點數量為190 個.然后選取一定數量的頻點上的阻抗信息用于訓練.

圖6 生物阻抗譜檢測實驗設備 (a) 實驗設備原理圖;(b) 傳感器結構圖Fig.6.Bioelectrical impedance spectroscopy instrument:(a) Schematic diagram of experimental equipment;(b) sensor structure diagram.

其中n表示測量點的數量;分別表示連續兩次所測阻抗譜的第i個頻率點的阻抗幅值.

3.2 實驗過程

制備了不同濃度的紅細胞懸浮液,其制備過程如下:小鼠在全麻條件下,取血液約1 mL,置于抗凝管中,向血液中加入等體積的生理鹽水混勻,然后在溫度為4 ℃、轉速為1500 r/m 的條件下離心5 min,結束后,棄去上清液中間白色細胞層,再用生理鹽水重懸紅細胞;重復 5次,以去除血液中的纖維蛋白原以及其他成分,防止細胞凝集;在室溫情況下,用等滲濃度的蔗糖溶液(0.308 mol/L)稀釋重懸紅細胞.利用自動細胞計數儀測定紅細胞濃度(5×108個/mL),然后等滲的蔗糖溶液將紅細胞稀釋成一系列體積濃度為10%,15%,20%,25%,30%,40%,50%的紅細胞懸浮液.另外取適量的蔗糖溶液作為對照組,記為體積濃度為0%的紅細胞懸浮液.紅細胞實驗共設置8組濃度類別,每組濃度類別利用阻抗分析儀連續測量 20次,共獲得160組阻抗譜數據,實驗時快速測量每種濃度紅細胞懸浮液的阻抗譜數據,并且在測量前重懸傳感器,使細胞達到隨機分布的狀態.

3.3 實驗結果與討論

通過對實驗得到的數據進行正則化處理,并利用MLR 回歸算法進行訓練和調參,得到了數據集的預測值與真實值,對比結果如圖7 所示,可以直觀地看到,MLR 的預測值與真實值非常接近.進一步地統計了數據集每種濃度的平均絕對誤差,如表3 所列,可以準確地得到,紅細胞懸浮液每種濃度下的平均絕對誤差在0.0132 附近波動.最后數據集在利用五折驗證,其結果如表4 所列,可以得到MLR 的平均擬合優度和均方誤差分別為0.9998和0.0079.

表3 每種紅細胞懸浮液濃度下的平均絕對誤差Table 3.The average absolute error of each red blood cell suspension concentration.

表4 MLR 回歸算法的五折交叉驗證結果Table 4.Cross validation results of MLR regression algorithm.

圖7 MLR 對數據集預測值與真實值的差異,內插圖是MLR 預測值與真實值的誤差放大圖像Fig.7.The difference between the predicted value and the true value of the data set by MLR.The inset is an enlarged image of the error between the MLR predicted value and the true value.

以上結果充分說明本文提出的細胞懸浮液濃度自動識別方法,可以準確快速地計算細胞懸浮液的濃度.而且實驗的總體結果與仿真結果基本一致,說明在數值仿真時,利用細胞位置隨機分布策略生成的生物阻抗譜數據集,挑選出的最優回歸模型是完全可以用于處理實驗數據,也說明了利用細胞隨機分布策略可以模擬出細胞的真實分布情況.但是實驗結果與仿真結果相比,稍有差異,原因是實驗數據有許多偶然因素(紅細胞每個時刻的活躍程度不同,每個濃度下紅細胞的大小、發育程度不完全相同,測量數據、配置溶液以及移液過程中不可避免的人為誤差等因素),使其數據有明顯波動,從而導致結果變化.

4 結論

本文提出了一種細胞懸浮液濃度自動識別方法,根據臨床經驗提出了細胞位置隨機分布策略并建立了細胞模型,通過數值仿真的方法研究了該方法的可行性,并且進行了實驗驗證,得到以下結論:

1)采用了細胞位置隨機分布策略,該策略可以模擬細胞真實分布情況;

2)所提出的細胞懸浮液濃度自動識別方法具有較好的仿真結果.仿真表明,MLR 是用于細胞濃度識別的最佳回歸模型,通過MLR 對阻抗譜數據集進行回歸處理,五折交叉驗證的平均擬合優度和均方誤差分別達到了0.9997和0.0008;

3)所提出的細胞懸浮液濃度自動識別方法在實驗中表現優異,能夠識別不同濃度的紅細胞懸浮液,通過MLR 對阻抗譜數據集進行回歸處理,五折交叉驗證的平均擬合優度和均方誤差分別達到了0.9998和0.0079,每種濃度樣本的平均絕對誤差在0.0132 附近波動;

4)所提出的細胞懸浮液濃度自動識別方法可應用于細胞濃度的檢測中,具有檢測速度快、操作簡便、檢測精度高的優點,并為細胞濃度的檢測方法提供了一種新的思路.

本文提供的細胞濃度檢測方法通用性較強,不僅可用于檢測細胞濃度,還能夠推廣到其他懸浮液濃度的檢測中,例如可檢測血栓濃度以實現對心腦血管疾病的術后判斷和藥效評估.