細(xì)辛水提物HPLC指紋圖譜及化學(xué)模式識別的研究*

薛子祥 ，王頌瑞，楊冬月 ，趙露露 ，歐陽慧子 ，常艷旭 ，何俊

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)組分中藥國家重點實驗室，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

細(xì)辛為馬兜鈴科植物北細(xì)辛Asarum heterotropoides Fr.Schmidt var.mands huricum（Maxim.）Kitag.、漢城細(xì)辛Asarum sieboldii Miq.var.seoulense Nakai或華細(xì)辛Asarum sieboldii Miq.的干燥根和根莖。前兩種習(xí)稱“遼細(xì)辛”[1]。細(xì)辛氣辛香、味溫，入肺、腎、心經(jīng)。細(xì)辛在中醫(yī)藥學(xué)上具有祛風(fēng)散寒、止痛、通竅、溫肺化飲等功效，臨床上常用于治療風(fēng)寒頭痛、鼻塞、牙痛、痰飲咳喘、關(guān)節(jié)痛等疾病[2]。近些年來對細(xì)辛的揮發(fā)性成分研究較多[3]，但對于細(xì)辛水提物的研究相對較少[4]。Huang等[5]指出具有特異性的“馬兜鈴酸突變指紋”會被含有馬兜鈴酸的中藥誘導(dǎo)從而誘發(fā)肝癌。細(xì)辛為馬兜鈴科植物，其非揮發(fā)性成分中含有馬兜鈴酸[6-7]。同時，中藥材在臨床上主要采用水煎煮的提取方法，在古代臨床上早有“細(xì)辛不過錢”的說法[8]。從中藥材細(xì)辛臨床安全用藥的角度考慮，需要建立一種高效、快速的分析檢測方法完善對細(xì)辛藥材水提物的質(zhì)量評價。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀（Agilent，USA）；Milli-Q IQ 7005 超 純 水 制 備 儀（Millipore公司）；5424R型高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；AS 60/220.R2型十萬分之一天平（波蘭RADWAG公司）；G3KT18273型旋渦混合器（賽默飛世爾科技公司）。

1.2 試藥 對照品細(xì)辛脂素（批號：DST180425-014）、馬兜鈴酸 A（批號：DST180413-021）、芝麻脂素（批號：MUST-1706301）、卡枯醇（批號：DST190325-028）、去甲烏藥堿（批號：DST190402-154）、槲皮素（批號：DST180521-028）購于成都德思特生物科技有限公司；甲醇為色譜純，購于美國Fisher公司；甲酸為色譜純，購于美國ROE公司；超純水由Milli-Q超純水儀制備。

1.3 樣品來源 10批細(xì)辛藥材分別來源于遼寧盤錦，遼寧丹東，遼寧本溪，遼寧沈陽，吉林白山，山西長治，云南本溪，遼寧錦州，吉林靖宇，遼寧新賓。經(jīng)何俊研究員鑒定分別為馬兜鈴科植物北細(xì)辛、漢城細(xì)辛以及華細(xì)辛表1為不同批次細(xì)辛的來源。

表1 樣品來源

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：A 相為 0.1%甲酸水，B相為甲醇。梯度洗脫，洗脫梯度為：0～3 min，3%B；3～15 min，3%～50%B；15～20 min，50%～80%B。流速為 1 mL/min，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10 μL，檢測波長285 nm。

2.2 對照品溶液的配制 精密稱定細(xì)辛脂素，馬兜鈴酸A，芝麻素，卡枯醇，去甲烏藥堿，槲皮素5.00mg，加入5 mL甲醇進(jìn)行溶解，得到濃度為1 mg/mL的各對照品儲備液，并置于4℃冰箱冷藏備用。

2.3 供試品溶液的配制 分別稱定10個不同批次的細(xì)辛5 g，加入純水定容至50 mL，加熱回流1 h，減壓干燥得浸膏約0.45 g。精密稱定浸膏5 mg，加水1 mL溶解，渦流振蕩，14 000 r/min離心10 min，用0.22 μm的微孔濾膜過濾，得上清液，置于4℃冰箱冷藏備用。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度實驗 取同一批細(xì)辛供試品溶液（S1），按“2.1”項色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測得各個共有色譜峰的峰面積和相對保留時間，計算RSD，結(jié)果見表2，結(jié)果表明此方法的精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性實驗 精密稱定細(xì)辛藥材水提物（S1）6份，每份 5 g，按照“2.3”項制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進(jìn)樣，測得各共有色譜峰的峰面積和相對保留時間，計算RSD，結(jié)果見表2，結(jié)果表明此方法的重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性實驗 取同一批細(xì)辛供試品溶液（S1），分別在時間點 0、2、4、8、12、24 h 下按“2.1”項色譜條件進(jìn)樣，測得各個共有色譜峰的峰面積和相對保留時間，計算RSD，結(jié)果見表2，結(jié)果表明樣品放置于室溫24 h條件下穩(wěn)定。

表2 細(xì)辛共有峰的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性結(jié)果

3 結(jié)果與分析

3.1 細(xì)辛HPLC指紋圖譜建立和相似度分析 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件（130723版，國家藥典委員會，2012），對10批細(xì)辛藥材水提物的實驗結(jié)果和數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用多點校正法建立細(xì)辛藥材水提物的指紋圖譜，指紋圖譜結(jié)果見圖1，共標(biāo)定出20個共有峰，其中有6個特征峰，依次為6號峰（去甲烏藥堿），16號峰（槲皮素），17號峰（卡枯醇），18號峰（馬兜鈴酸A），19號峰（芝麻素），20號峰（細(xì)辛脂素）。混合對照品圖譜見圖2，10批細(xì)辛藥材水提物的相似度分析結(jié)果見表3。10批樣品的相似度結(jié)果均在0.908以上，初步說明3種基源的細(xì)辛藥材水提物質(zhì)量相對均一穩(wěn)定，推測這可能是北細(xì)辛、漢城細(xì)辛、華細(xì)辛3種基源的細(xì)辛均被藥典收錄的原因。

圖1 10批細(xì)辛藥材水提物的疊加特征圖譜

圖2 混合對照品色譜圖

表3 10批細(xì)辛藥材水提物的相似度分析結(jié)果

3.2 化學(xué)模式識別方法

3.2.1 聚類分析（HCA） 為了對指紋圖譜的結(jié)果進(jìn)行補(bǔ)充，本研究以10批細(xì)辛指紋圖譜中20個共有峰的相對峰面積為變量，導(dǎo)入SPSS 25.0軟件，采用組間聯(lián)接法，以歐氏距離為測度進(jìn)行聚類分析[9]。聚類分析結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，當(dāng)距離刻度為15時，10批細(xì)辛藥材水提物主要分為3類R1、R2、R3。R1中S6、S7、S8、S9均為北細(xì)辛，4批藥材分別來源于山西長治、云南玉溪、遼寧錦州、吉林靖宇，4批藥材的基源相同來源不同被分為了一類；R2中S4和S5均為北細(xì)辛，分別來源于遼寧沈陽和吉林白山；S1為華細(xì)辛，來源于遼寧盤錦；S10為漢城細(xì)辛，來源于遼寧新賓，4批藥材中S4和S5與S1、S10的基源不同均來源于東北三省；R3中S2為北細(xì)辛，來源于遼寧丹東；S3為漢城細(xì)辛，來源于遼寧本溪。2批藥材的基源不同均來源于遼寧省。10批細(xì)辛藥材水提物的聚類結(jié)果表明不同產(chǎn)地及基源的細(xì)辛藥材水提物間存在一定的質(zhì)量差異。此外，聚類結(jié)果并不是按照藥材的基源或者是藥材的產(chǎn)地某單一變量作為劃分，該結(jié)果為今后細(xì)辛藥材水提物的質(zhì)量研究提供參考。

圖3 10批細(xì)辛藥材水提物聚類分析圖

3.2.2 偏最小二乘判別分析（PLS-DA） 為了印證HCA的結(jié)果，本研究以指紋圖譜中20個共有峰的峰面積為變量，構(gòu)建20×10的原始數(shù)據(jù)矩陣，使用SIMCA14.1統(tǒng)計軟件對10批細(xì)辛藥材水提物進(jìn)行無監(jiān)督模式的PLS-DA，Par作為標(biāo)度化方式，繪制出PLS-DA 3D分析圖，見圖4。由圖4可知R1、R2、R3分別聚集在不同的區(qū)域，其分類結(jié)果與HCA結(jié)果一致，印證了HCA的結(jié)果。說明不同產(chǎn)地及基源的細(xì)辛藥材水提物間存在一定的質(zhì)量差異。

圖4 10批細(xì)辛藥材水提物PLS-DA 3D圖

3.2.3 正交偏最小二乘-判別分析（OPLS-DA） 為了進(jìn)一步印證PLS-DA的結(jié)果，本研究以指紋圖譜中20個共有峰的峰面積為變量，構(gòu)建20×10的原始數(shù)據(jù)矩陣，使用SIMCA14.1統(tǒng)計軟件對10批細(xì)辛藥材水提物進(jìn)行具有監(jiān)督模式的OPLS-DA，見圖5。由模型分析驗證參數(shù)可知，結(jié)實率參數(shù)R2X為0.807，區(qū)分參數(shù)R2Y為0.919，預(yù)測參數(shù)Q2為0.885，以上數(shù)據(jù)均大于0.5且原始數(shù)據(jù)矩陣中沒有異常值，表明該模型穩(wěn)定并且具有較好的預(yù)測準(zhǔn)確性[10-13]。由圖5可知R1、R2、R3分別聚集在不同的區(qū)域，其分類結(jié)果與PLS-DA的結(jié)果一致，印證了PLS-DA的結(jié)果。進(jìn)一步說明了不同產(chǎn)地及基源的細(xì)辛藥材水提物間存在一定的質(zhì)量差異。

圖5 10批細(xì)辛藥材水提物的OPLS-DA散點圖

3.2.4 主成分分析（PCA） 為進(jìn)一步評價不同基源和產(chǎn)地的細(xì)辛藥材水提物的質(zhì)量，本研究以10批細(xì)辛指紋圖譜中20個共有峰的相對峰面積為變量，導(dǎo)入SPSS 25.0軟件對10批細(xì)辛藥材水提物進(jìn)行PCA。結(jié)果將20個變量降維成5個主要成分，其方差累積貢獻(xiàn)率為95.417%，綜合了10批細(xì)辛藥材水提物20個共有峰的大部分信息，相關(guān)矩陣的特征系數(shù)及方差貢獻(xiàn)率見表4。主成分綜合得分和排序見表5。結(jié)果對HCA、PLS-DA以及OPLS-DA的結(jié)果進(jìn)行了補(bǔ)充。PCA結(jié)果表明10批細(xì)辛藥材水提物中，S4得分最高，可初步認(rèn)為來源于本溪的漢城細(xì)辛在10批細(xì)辛藥材水提物中的質(zhì)量相對較好，該結(jié)果為今后細(xì)辛藥材水提物的質(zhì)量研究提供參考。

表4 特征系數(shù)及方差貢獻(xiàn)率

表5 主成分綜合得分和排序

得到的5個主成分的得分計算公式和綜合得分計算公式如下

4 討論

實驗分別考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水流動相體系對色譜峰的影響，發(fā)現(xiàn)甲醇-0.1%甲酸水為流動相時，色譜峰峰形及分離效果較好。故選擇甲醇-0.1%甲酸水作為流動相體系；對樣品溶液進(jìn)行254nm，285nm，320nm檢測波長進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)檢測波長為285 nm時基線相對平穩(wěn)，所有色譜峰響應(yīng)相對較大，故選擇285 nm作為檢測波長。

中藥指紋圖譜技術(shù)是一種能夠用于鑒別中藥真?zhèn)巍^(qū)分基源、評價優(yōu)劣以及保證其穩(wěn)定性和一致性的高效快速的分析檢測方法[14]。但由于中藥本身化學(xué)成分復(fù)雜，再加上產(chǎn)地不同、基源不同等影響因素，僅使用相似度評價系統(tǒng)并不能全面的、多層次的對中藥材進(jìn)行質(zhì)量評價，需要結(jié)合其他分析方法對結(jié)果進(jìn)行分析[15-16]。

化學(xué)模式識別是使用統(tǒng)計學(xué)或數(shù)學(xué)方法將化學(xué)體系的測量值與體系的整體建立聯(lián)系，廣泛應(yīng)用于中藥材的鑒定、表征、質(zhì)量評價及質(zhì)量控制等研究中[17]。化學(xué)模式識別分為無監(jiān)督的模式識別和有監(jiān)督的模式識別，在使用化學(xué)模式識別分析數(shù)據(jù)時，單獨(dú)使用一種模式識別往往缺少科學(xué)性和代表性，因此常將兩種模式結(jié)合起來相互驗證、相互補(bǔ)充[18]。本實驗采HPLC法建立細(xì)辛藥材水提物的指紋圖譜，并將HCA、PLS-DA、OPLS-DA和PCA聯(lián)合使用，對所得指紋圖譜進(jìn)行綜合分析，將多種分析方法聯(lián)合使用使得分析結(jié)果較大程度地避免了人為因素所帶來的誤差[19]。幾種分析結(jié)果相互驗證相互補(bǔ)充，使得分析結(jié)果更加可靠[20]。本實驗初步評價了不同基源和產(chǎn)地的細(xì)辛藥材水提物的質(zhì)量。這些結(jié)果較好地闡明了細(xì)辛水提物內(nèi)在的質(zhì)量特征，并進(jìn)一步完善了對于細(xì)辛藥材的質(zhì)量評價。