膳食纖維對大鼠腦缺血后PTEN/PI3K/Akt/NF-κB 信號通路的影響

楊事達 曲慧玲

1.遼寧省人民醫院檢驗科，遼寧沈陽 110015；2.北部戰區總醫院神經內科，遼寧沈陽 110016

腦梗死可誘導病理生理級聯反應，包括最初的興奮性毒性，隨后是較長的神經炎癥期[1]。此外，腦梗死可以被視為一種系統性疾病，也影響遠程器官功能，包括肺及免疫系統和腸道功能[2]。最近，有研究表明，腸道菌群異常與患者的預后惡化相關[3-4]，并且這些變化在住院后3 周內都很明顯。嚙齒類動物腦梗死模型的進一步實驗研究已經確定了免疫系統在沿著腸-腦軸介導過程中起著關鍵作用[5-6]。腸道微生物組產生大量生物活性代謝物可能通過調節免疫系統或傳入神經通路影響大腦功能，特別是短鏈脂肪酸（shortchain fatty acid，SCFA），其中的醋酸鹽、丁酸鹽和丙酸鹽已被證明容易越過血腦屏障，并影響大腦在發育、健康和疾病中的功能[7-9]。例如，SCFAs 治療通過促進抗炎機制和減少軸突損傷來改善實驗性自身免疫性腦炎的病程[10]。盡管腸道微生物組對腦梗死預后有重要貢獻，并且SCFAs 是微生物組的主要生物活性介質之一，但SCFAs 在腦缺血后慢性期腦梗死后恢復中的作用及其潛在治療用途尚未得到研究。本研究探討添加膳食纖維后對腦梗死后大鼠腦內炎癥反應通路的調控。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年雄性Wistar 大鼠，體重200～250 g，由中國醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物合格證號：211002300052024，動物許可證號：SCXK[遼]2015-0001，所有動物實驗操作程序符合中國醫科大學倫理委員會管理條例要求。

1.2 儀器與試劑

ET-1 購于美國Sigma-Aldrich 公司，產品批號：E6877；Anti-PTEN 抗體購于美國Abcam 公司，產品批號：ab 267787；Anti-p-PI3K 抗體購于美國Abcam公司，產品批號：ab 278545；Anti-p-Akt 抗體購于美國Abcam 公司，產品批號：ab38449；Anti-PI3K 抗體購于美國Abcam 公司，產品批號：ab32089；Anti-Akt 抗體購于美國Abcam 公司，產品批號：ab 108202；Anti-NF-κB/p65 抗體購于美國Abcam 公司，產品批號：ab 207297；Anti-β-Actin 抗體購于美國Abcam 公司，產品批號：ab115777。微量注射器（型號：87943）購于美國Hamilton 公司；蛋白電泳儀（型號：PowerPac HV）購于美國Bio-Rad 公司；電轉膜裝置（型號：Trans-Blot?TurboTM）購于美國Bio-Rad 公司；搖床購于德國Heidolph（型號：6173000）公司。

1.3 研究方法

1.3.1 實驗動物分組 隨機選取24 只大鼠顱內注射內皮素（endothelin，ET-1）制作腦缺血模型，模型制作完成后4 只大鼠死亡。剩余20 只大鼠按照隨機數字表法分為缺血組和缺血+膳食纖維組，每組10 只；另隨機取10 只大鼠作為假手術組，大鼠顱內注射生理鹽水作為對照，假手術組的大鼠均存活。

1.3.2 腦缺血模型的制作方法 將ET-1 用生理鹽水稀釋成0.5 μg/μl，注射點為以下3 點（根據大鼠腦解剖圖譜，AP 示以前囟為中心向前，ML 示以前囟為中心向側方，DV 示以前囟為中心向下方）[11-12]：①AP+0.7 mm、ML+2.2 mm、DV-2.0 mm；②AP+2.3 mm、ML+2.5 mm、DV-2.3 mm；③AP+0.7 mm、ML+3.8 mm、DV-5.8 mm。ET-1 用微量注射器以0.5 μl/min 注射。注射ET-1 后約3 h（此時大鼠麻醉已清醒）若大鼠出現提尾倒懸時右上肢向胸前屈曲或行走時向右側傾倒或向右側轉圈，且癥狀持續超過24 h，則可判定為缺血模型制作成功[13]。

1.3.3 膳食纖維的添加 在大鼠飼養過程中，7～35 d 給予膳食纖維經口喂入，每周固定兩天添加飼料，其他時間可根據大鼠進食情況隨時注意添加。正常飲食組即缺血組和假手術組飼料成分配比如下：玉米淀粉為465.692 g/kg、絡蛋白為140.000 g/kg、糊精玉米淀粉為155.000 g/kg、蔗糖為100.000 g/kg、大豆油為40.000 g/kg、纖維素為50.000 g/kg、礦物混合物（AIN-93M）為35.000 g/kg、維生素混合物（AIN-93）為10.000 g/kg、L-胱氨酸為1.800 g/kg、膽堿酒石酸為2.500 g/kg、丁基化羥基甲苯為0.008 g/kg。缺血+膳食纖維組飼料成分配比如下：玉米淀粉為465.692 g/kg、絡蛋白為140.000 g/kg、果膠為25.000g/kg、糊精玉米淀粉為25.000g/kg、蔗糖為100.000 g/kg、大豆油為40.000 g/kg、纖維素為150.000 g/kg、礦物混合物（AIN-93M）為35.000 g/kg、維生素混合物（AIN-93）為10.000 g/kg、L-胱氨酸為1.800 g/kg、膽堿酒石酸為2.500 g/kg、丁基化羥基甲苯為0.008 g/kg。

1.3.4 梗死體積的測量 第40 天時，使用尼氏染色測量缺血組和缺血+膳食纖維組之間腦梗死的體積的差異。通過NIH Image J 軟件進行測量，得到總的梗死體積。

1.3.5 Western blot 腦缺血術后40 d，把每組大鼠麻醉，提取梗死周邊組織。提取蛋白，然后進行蛋白定量、按照每個孔上樣10 μl，含總蛋白50 μg，上樣2 μl緩沖液。充分混勻后，金屬浴5 min，儲存于-20℃。聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳接受后進行轉膜。轉膜完成后，室溫封閉1 h。然后進行雜交和顯色，Image J 軟件分析條帶灰度值。

1.4 統計學方法

采用SPSS 16.0 軟件對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組梗死體積比較

缺血組梗死體積為（130.853±11.462）mm3，與缺血+膳食纖維組梗死體積[（127.371±9.857）mm3]比較，差異無統計學意義（t=0.728，P=0.475）。

2.2 膳食纖維對大鼠腦缺血后PTEN/PI3K/AKT/NF-κB 信號通路蛋白表達的影響

缺血組的p-PI3K、p-Akt 的蛋白表達低于假手術組，差異有統計學意義（P ＜0.05）；缺血+膳食纖維組的p-PI3K、p-Akt 的蛋白表達高于缺血組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。缺血組的PTEN、NF-κB/p65 的蛋白表達高于假手術組，差異有統計學意義（P ＜0.05）；缺血+膳食纖維組的PTEN、NF-κB/p65 的蛋白表達低于缺血組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見圖1。

3 討論

本研究證實了腸道菌群及其代謝產物SCFAs 可以作為一種干預“靶點”，通過針對性地對他們進行調控，就有可能通過調控梗死后的炎癥反應從而在腦梗死的治療及神經功能的恢復等方面發揮作用。本課題組前期工作表明添加膳食纖維能夠抑制小膠質細胞的激活，膳食纖維可以被腸道菌群代謝發酵而產生SCFAs[14]。通過對小膠質細胞功能的調節作用，可促進腦卒中后恢復[8]。SCFAs 對腦卒中后恢復和神經元可塑性的影響可能是通過小膠質細胞活動間接介導的，與樹突重塑和小膠質細胞的重塑有關[15-17]。研究表明腦梗死后補充SCFAs 后細胞分支增加，提示小膠質細胞活化狀態降低。因此，SCFAs 對小膠質細胞激活的修飾可能會對突觸消除產生影響，從而影響小膠質細胞依賴性突觸可塑性[18]。RNA Seq 分析結果表明，SCFAs 在這一過程中主要抑制小膠質細胞的激活[8]。

NF-κB 是廣泛已知的與腦缺血后小膠質細胞活化的關鍵轉錄因子[19]。PI3K/Akt 信號是NF-κB 信號通路的主要上游元件。PI3K/Akt 信號通路在神經元中表達最為明顯，而在神經膠質細胞內也有表達。以前的研究表明，Akt（Thr-308 和Ser-473）的磷酸化是Akt 活化的原因。Akt 是一種主要的神經保護因子。Akt 磷酸化的增加反映了Akt 活性的增加。PI3K/Akt信號轉導參與了基因表達的調控。然而，PTEN 基因可以負向調控PI3K/Akt 信號通路。PTEN 在中樞神經系統發育中也起到一定的作用[20]。近年來，人們對PTEN抑制劑在腦缺血損傷中的研究表明在腦缺血后，PTEN 過度表達，并通過PI3K/Akt 途徑參與缺血性卒中的發生[21-25]。此外，Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）是先天性免疫反應的主要組成部分，其配體脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）可以激活大鼠海馬神經元的興奮。LPS 可以激活細胞內磷酸酶活性通過蛋白的去磷酸化導致PTEN 活化，進而抑制Akt 磷酸化，TLR4 的活化通過去磷酸化激活PTEN，TLR4 的解離通過去磷酸化激活第二信使PIP3，抑制PI3K，從而抑制下游因子Akt 的活化，最終導致NF-κB 的釋放，而LPS對PTEN 和Akt 磷酸化狀態的影響通過阻斷TLR4 激活而逆轉。那么調控PTEN/PI3K/Akt/NF-κB 信號通路，則能夠抑制腦缺血后小膠質細胞的激活，進而抑制腦缺血后的炎癥反應。而SCFAs 發揮作用的機制其中一條是通過上調PI3K/Akt 信號，抑制NF-κB 通路的激活[26-27]。本研究結果顯示SCFAs 抑制了PTEN 的表達，從而調控PI3K/Akt/NF-κB 信號通路。添加膳食纖維后，應用Western blot 方法測定梗死周圍組織NF-κB 表達水平，結果發現，與缺血組比較，膳食纖維產生的SCFAs 增多，該組大鼠腦梗死周邊區域PTEN 降低，p-PI3K 及p-Akt的表達明顯增高，而細胞核NF-κB/p65 水平顯著降低。

本研究顯示腦梗死后添加膳食纖維能夠抑制了PTEN 的表達，上調PI3K/Akt 信號，抑制NF-κB 通路的激活，有效抑制缺血后小膠質細胞的活化，這些研究成果為臨床治療帶來新的方法。