骨肉瘤生長侵襲相關調控蛋白的研究進展

夏安然，羅群強，甘林

1.右江民族醫(yī)學院，廣西百色 533000；2.右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院手足外科/小兒骨科，廣西百色 533000

骨肉瘤是一種最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤，一般在兒童以及青少年群體中發(fā)病率較高，臨床工作中常見骨肉瘤集中在長骨干骺端，目前在臨床上針對骨肉瘤的治療手段多采用手術切除腫瘤，結合全身化療以控制微轉移瘤。根據(jù)最近幾年的臨床統(tǒng)計，原發(fā)性骨肉瘤患者的五年生存率約為70%，但進展的轉移性或復發(fā)性疾病患者的總生存率低于20%。雖然隨著各項研究開展，臨床中對骨肉瘤的了解不斷加深，而且在臨床試驗中多次通過改變化療藥物劑量或者嘗試研發(fā)新型的化療藥來加強療效。令人沮喪的是，由于骨肉瘤的特異性較大，目前對骨肉瘤患者的臨床治愈能力依舊沒有明顯提升，導致骨肉瘤患者的預后并不理想。特別是一些在初診時就已經(jīng)確定發(fā)生腫瘤轉移的患者，其五年生存率只有20%左右。近年來，采用針對性療法改進治療方案提升患者預后生存率的問題依舊存在，然而卻面臨著缺乏特定研究目標的困擾。根據(jù)目前的研究進展來看，針對性治療骨肉瘤的靶向化療藥物或更加完善的臨床治療方案尚未成型。因此，尋找合適的生物標志物對骨肉瘤的早期監(jiān)測及臨床治療具有重要的意義。本文通過對骨肉瘤生長侵襲中的相關調控蛋白的研究進展進行歸納綜述，從而為骨肉瘤的針對性治療、提高患者生存率找出新的治療方案，進一步為臨床治療骨肉瘤提供科學依據(jù)。

1 Survivin 蛋白

生存素[1]（也稱為Survivin、BIRC5）是一種進化保守的真核蛋白，在細胞分裂中的作用至關重要，可以抑制細胞死亡。通常，它僅在活躍的增殖細胞中表達，尤其在大多數(shù)癌癥中表達上調。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，生存素在細胞內的抗凋亡作用與半胱天冬酶蛋白（caspase）直接和間接相關[2]。生存素基因是迄今為止發(fā)現(xiàn)最強的凋亡抑制基因，細胞凋亡是一種程序性死亡的主要形式，主要依賴于半胱天冬酶，在體內有兩種凋亡途徑：內在途徑和外在途徑，當接收到內源性應激信號時，線粒體釋放細胞色素C，同時導致半胱天冬酶9（caspase-9）的激活從而調控細胞凋亡；相比之下，外源性途徑則屬于線粒體非依賴性，并且由配體與細胞表面受體的結合觸發(fā)效應。兩種途徑都有半胱天冬酶3 和7（caspase-3、caspase-7）存在，其通過分離下游大分子導致細胞凋亡。近年來的研究重心已將生存素作為腫瘤治療的潛在藥物靶點。研究表明，caspase 在臨床上的大多數(shù)癌癥中都呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，且高度影響患者預后情況，而且通過caspase 在癌癥細胞中的高表達同樣可以用來判斷其癌癥細胞的增殖能力以及預測治療效果，而caspase 在骨肉瘤的增殖分化以及生長侵襲中同時具有重要作用[3]。這種關聯(lián)表示生存素在骨肉瘤的生長侵襲中同樣也具有一定的相關性。夏鵬等[4]通過構建特異性siRNA，將siRNA 轉錄至骨肉瘤MG-63 細胞中。并檢測在MG-63 細胞中FANCD2 基因的表達強度，實驗結果證明，降低FANCD2 基因在細胞中的表達，則p53信號通路開始調控細胞凋亡。當FANCD2 基因表達受抑制時，細胞內TP53INP1 基因表達上調，該基因可促進p53 的磷酸化，導致p21 蛋白被激活，從而影響依賴caspase 介導的骨肉瘤MG-63 細胞，加速其發(fā)生凋亡[5]。這與王玉峰等[6]的實驗結果相似。丁艷平等[5]則是通過選取45 例口腔癌石蠟標本，利用免疫組化方法將各個分組的口腔癌細胞的生存素以及caspase-3 進行染色，通過不同陽性染色程度進行區(qū)分總結，最后發(fā)現(xiàn)，隨著口腔癌增生分化的嚴重程度增加，caspase-3 的陽性染色逐漸降低，生存素的表達逐漸升高。caspase-3 的表達被抑制，癌細胞增殖分化較前明顯升高。而王玉峰等[6]在研究二硫代氨基甲酸吡咯烷（pynolidine dithiocarbamate, PDTC）抑制骨肉瘤MG-63 細胞的實驗中，通過體外構建不同濃度的PDTC 培養(yǎng)骨肉瘤細胞，發(fā)現(xiàn)不同濃度的PDTC 對骨肉瘤細胞抑制效果完全不同，進行細胞實驗驗證后認為PDTC 通過促進半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3（caspase-3）蛋白的表達，從而促進骨肉瘤細胞凋亡，抑制骨肉瘤細胞增殖分化。同時因為生存素對caspase-3 有直接抑制作用，二者表達程度成反比，從而認為生存素對于骨肉瘤癌細胞的生長侵襲以及后續(xù)的分化復發(fā)有明顯促進作用。

2 TRIM35 蛋白

三方基序（tripartite motif, TRIM）家族是具有高度保守結構域的蛋白質家族。TRIM 家族蛋白的成員在癌癥的發(fā)展和進展中起著至關重要的作用[7]。而在癌細胞生長侵襲過程中，蛋白質的翻譯后修飾參與調節(jié)許多生物過程。其中泛素化是針對賴氨酸殘基并調節(jié)許多細胞過程的翻譯后修飾之一。目前研究表明，細胞實現(xiàn)泛素化反應需要3 種酶[8]：泛素激活酶（E1）、泛素結合酶（E2）和泛素連接酶（E3）。有研究指出，在癌細胞的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)產生的生化反應中，泛素的結合反應由E1、E2 和E3 催化[9]。E3 是介導E2 和底物之間的支架，負責底物識別。而三元基序家族蛋白由于具有較高程度的E3 泛素連接酶活性[10]。所以在癌癥、炎癥性疾病和與生長相關疾病等多種疾病中均發(fā)揮調控作用[11]。TRIM 家族的其他成員與癌癥發(fā)展有關，而不參與染色體的重新排列，目前看來可能就是通過泛素化或腫瘤抑制其蛋白功能喪失。而研究表明，TRIM35 在影響骨肉瘤生長侵襲過程中，可以通過介導上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）的方式促進骨肉瘤細胞的生長侵襲以及增殖分化[12]。EMT 是一種細胞程序，在人體內對胚胎發(fā)生、傷口愈合和惡性進展至關重要。在EMT 被激活的情況下，癌癥干細胞在人體中增長速度較前明顯加快，直接加速了癌癥的生長侵襲。目前Yu L 等[13]通過實驗發(fā)現(xiàn)，EMT 與間質源性骨肉瘤相關。張杰等[7]通過免疫組化法發(fā)現(xiàn)TRIM35 在骨肉瘤組織中表達較正常組織顯著提高。通過細胞劃痕試驗印證了過表達TRIM35 能夠顯著提高骨肉瘤細胞在組織中的遷移能力。而上述的研究結論均可以表明在骨肉瘤的生長侵襲以及預后轉移的過程中，TRIM35 可以通過影響EMT 在組織中的表達能力，消除上皮細胞的極化，從而促進間質細胞的轉移，進一步增加骨肉瘤癌細胞的生長侵襲能力。

3 Neurensin-2 蛋白

神經(jīng)膜蛋白2（neurogenin 2, NRSN2）是一種小神經(jīng)元膜蛋白，定位于神經(jīng)細胞中的小囊泡中。有研究文獻報道NRSN2 主要參與肝細胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）以及非小細胞癌（non-smallcell lung cancer, NSCLC）的發(fā)生發(fā)展。Keremu A等[14]通過生物信息學分析方法在GEO 數(shù)據(jù)庫找出NRAN2 蛋白，發(fā)現(xiàn)其在骨肉瘤組織中高度表達。經(jīng)過研究證實，目前NRSN2 的表達在18 個新的骨肉瘤組織中更加常見。NRSN2 通過直接影響PI3K/AKT/mTOR 信號傳導和間接影響Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導來促進骨肉瘤細胞在體內的生長侵襲。PI3K/Akt 是一條在多種癌細胞中發(fā)揮作用并高度活躍的信號傳導通路[15]。大量證據(jù)表明，許多與癌細胞生長高度相關的轉化因子通過PI3K/Akt 途徑促進骨肉瘤組織的進一步惡化增殖[16-17]。PI3K/Akt在腫瘤的絕大多數(shù)惡性表型中都高度活躍，包括腫瘤生長侵襲、癌細胞增殖轉移等[18]。根據(jù)文獻報道，NRSN2 在組織中通過抑制或促進PI3K/Akt 信號傳導通路以抑制或促進癌細胞凋亡或增殖[19]。Wnt信號傳導通路在癌細胞生長侵襲過程中同樣具有重要作用，研究表明，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導在骨肉瘤細胞增殖中確實發(fā)揮著不可或缺的作用，其中，在Wnt 信號傳導通路中最重要的就是β-連環(huán)蛋白（β-catenin）[20]。由于PI3K/Akt 信號傳導通路可以抑制GSK3β 的活化[21]，從而影響到GSK3β 對β-連環(huán)蛋白的降解，導致β-連環(huán)蛋白降解速度變慢，從而抑制骨肉瘤細胞的凋亡。最新研究進展發(fā)現(xiàn)，由人骨髓間充質干細胞中所產生出的miR-1913 的外泌體轉移也可以通過靶向NRSN2 抑制骨肉瘤的增殖生長[22]。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）在腫瘤微環(huán)境中的許多關鍵性的調節(jié)作用均依賴于各種機制，包括分泌細胞外囊泡。外泌體就屬于BMSCs 所分泌的細胞外囊泡之一。外泌體通過傳遞各種核酸來參與細胞增殖生長以及轉移分化[23]。Yu L 等[13]通過IHC 染色以及蛋白質印記等方法發(fā)現(xiàn)，相較于正常組織，NRSN2 在骨肉瘤組織中的表達上調。并通過實驗研究表明，NRSN2 在骨肉瘤中的表達高度與骨肉瘤的增殖生長以及預后不良成正相關。

4 LATS2 蛋白

LATS 家 族蛋 白，包 括LATS1 和LATS2，LATS（大型腫瘤抑制因子）家族的腫瘤抑制因子（LATS1和LATS2）在維持細胞穩(wěn)態(tài)過程中作用顯著[24]。LATS 功能繁多，包括調節(jié)細胞增殖、細胞死亡和細胞遷移，通常在各種細胞中均參與調控，如轉錄調控和維持遺傳穩(wěn)定性。LATS 的活性通過各種機制受到嚴格控制，包括翻譯后修飾，差異定位和表達。LATS1 或LATS2 的功能失調常會使細胞惡性增生，逐漸向腫瘤轉化。它們的高度同源性和功能重疊，在Hippo-LATS 信號通路中早已得到印證，雖然對這些活動的具體潛在機制知之甚少，但目前的數(shù)據(jù)表明，LATS 信號傳導與成熟的腫瘤抑制或致癌途徑 相 交，包 括p53，Ras 或Akt 網(wǎng) 絡。人LATS1 和LATS2 是AGC 亞家族的Ser/Thr 激酶，與核Dbf2 相關激酶（NDR1/2）關系最密切[25]。而Hippo-LATS 通路[26]中的激活因子Yes 相關蛋白[27]（YAP）和轉錄共激活因子PDZ 結合基序[28]（TAZ）的表達異常在大多數(shù)軟組織腫瘤中影響頗深，YAP 不僅參與細胞增殖分化，同樣也是重要的預后標志物[29]，而TAZ 對腫瘤干細胞自我更新及腫瘤形成能力起重要作用[30]，當然也可影響上皮-間充質轉化[31]，臨床上與腫瘤的復發(fā)關系密切[32]。LATS 激酶對于生物體健康，基因組完整性和癌癥預防至關重要。對于LATS2蛋白而言，p53 可以直接與LATS2 啟動子相互作用以誘導LATS2 表達。之前文獻報道，LATS2 和YAP/TAZ 之間的這種負反饋回路有助于抑制YAP 活動的持續(xù)時間[33-34]，維持體內平衡并使Hippo 通路更加穩(wěn)定，以抵抗YAP 過度表達所產生的致癌作用[35]。實驗證明，當LATS2 缺失，加速了YAP 誘導的腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展[36]。這表明保留LATS2 蛋白的高表達實際上有時可能對腫瘤有益[37]。作為LATS 家族蛋白，LATS1 與LATS2 對細胞的作用不同[38]，實驗表明，癌細胞中與LATS1 相關的蛋白質與雌激素信號傳導有關[39]，而LATS2 已經(jīng)進化出與細胞周期、代謝和p53 相關的發(fā)散相互作用組[40]。p53 過表達將會導致骨肉瘤在內的大多數(shù)癌細胞凋亡。而在體內LATS2 和YAP/TAZ 之間的相互作用又可以減少YAP 的活動時間[41-42]，通過鞏固Hippo通路達到抑癌效果[43]。最新研究表明，骨肉瘤癌細胞中的Hippo/YAP 和Wnt/β-連環(huán)蛋白兩種信號通路不僅對生理成骨發(fā)揮重要作用，而且對骨肉瘤的生長侵襲至關重要[44-45]。這兩條信號通路之間關系緊密，尤其，β-catenin 可以彌補YAP-敲除MSCs中的成骨缺陷[46]。激酶LATS2 嚴格控制YAP 的活性[47]：通過在Ser127 磷酸化YAP，LATS2 促進了細胞核的退化[48]，隨后YAP 的細胞質降解。因此，LATS2 能有效拮抗YAP/β-連環(huán)蛋白信號傳導[49-50]。Hippo 通路在骨肉瘤的肺轉移中也占有很重要的地位[51]。所以這也表明LATS2 蛋白對骨肉瘤癌細胞的發(fā)生發(fā)展以及預后治療都具有較明顯的抑制作用。為骨肉瘤的預后治療提供了潛在的策略以及研究方向[52]。

5 總結與展望

目前與骨肉瘤生長侵襲有關的相關蛋白正在越來越全面地被發(fā)現(xiàn)，上述四種蛋白只是在近年實驗研究中相較于其他蛋白而言，對骨肉瘤生長侵襲影響更深。骨肉瘤作為一種治愈難度高、預后較差的惡性腫瘤，其在人體內的發(fā)生發(fā)展具有相當復雜的發(fā)病機制。當然還有許多尚未被研究發(fā)現(xiàn)所闡明的蛋白在人體內發(fā)揮著重要作用。在骨肉瘤的蛋白作用機制中，單一蛋白或是多重蛋白相互結合對骨肉瘤的生長侵襲更具主導作用，還需要進一步地進行實驗論證。但令人堅信的是，以此為切入點進行更加深入全面的研究對臨床靶向治療骨肉瘤提供了更好的新思路。

由于骨肉瘤的惡性程度較高，其在臨床上的治愈率較低，骨肉瘤細胞的高度活躍能力以及基因高表達使骨肉瘤在早期就對機體造成嚴重的破壞，并且隨著轉移復發(fā)情況的出現(xiàn)，更進一步地降低了骨肉瘤患者的生存率以及預后。隨著臨床化療耐藥性的逐漸增加，單純靶向治療骨肉瘤的新方法尤其被需要，這就需要更加全面深入地研究骨肉瘤生長侵襲的特性以及蛋白標志物，追根究底，研究出新型的低耐藥的靶向治療藥物，更好地抑制骨肉瘤癌細胞在體內的增殖分化，從而更好地提升患者預后以及生存率，從根本上解除患者病痛。目前國內外對于骨肉瘤的研究正在逐漸地從簡單的發(fā)生機制研究向細胞內基因表達信號通路以及蛋白標志物上進行轉變，對于骨肉瘤的生長侵襲研究已經(jīng)日趨完善，接下來，通過研究其特異性蛋白標志物和能夠影響其發(fā)生發(fā)展的主要信號通路并進行實驗驗證，從而找出更好更新穎的治療骨肉瘤的方法是當前要開展的工作。通過抑制其主要的相關信號通路以及促進特異性蛋白標志物失活來達到抑制骨肉瘤生長侵襲的作用，為研究出骨肉瘤的單純靶向治療藥物進一步提供更好的理論支撐，為臨床上提供更完善的治療計劃，從而開發(fā)出更具有特異性的抗癌藥物。