增溫和增氮對天津濱海濕地蘆葦凋落物分解微生物群落組成和多樣性的影響

王麗霞，郭宏宇，霍玉珠，龐金玲，王歡歡，馬成倉，王銀華

（1.天津師范大學 生命科學學院，天津 300387；2.天津師范大學 天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387）

氣候變暖是當前全球變化的重要方面，生態系統對全球變暖的響應已成為生態學研究熱點之一.氮素是生態系統中的重要營養元素，近年來由于人為活動導致的氮排放急劇增加，對生態系統的結構、功能及穩定性造成了不同程度的負面影響，關于氮輸入增加對生態系統的影響也成為生態學研究前沿問題之一[1].濱海濕地是位于陸地和海洋間的獨特生態系統，在凈化水體、涵養水源、保持生物多樣性和區域生態平衡方面發揮著重要作用[2].在全球變暖的背景下，濱海濕地面臨著溫度升高帶來的挑戰[3]，同時由于近年來大量的人為氮排放，濱海濕地氮污染問題也日趨嚴峻[4].有研究表明，貫穿京津地區的海河水系氮輸入量達13.3 g/（m2·a），存在嚴重的氮污染情況[5].在濱海濕地生態系統中，微生物驅動的凋落物分解是生態系統物質循環和能量轉換的重要環節[6].

本研究通過模擬增溫和增氮控制交互實驗，分析天津濱海濕地蘆葦凋落物可培養細菌和真菌群落的組成及多樣性在不同增溫和增氮條件下的差異，揭示濱海濕地凋落物分解微生物群落在氣候變暖和氮輸入急劇增加背景下的響應模式，為合理利用濱海濕地微生物資源，有效保護和恢復濱海濕地生態系統提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2019年10月，在天津濱海濕地采集原狀土壤，從環境條件一致的典型蘆葦濕地（38°41′N，117°23′E）中，用環刀采樣器采集土樣（0~20 cm）.共采集土樣18份，分別放置于18個栽培盆中（直徑15 cm，高20 cm，底部有透水孔），帶回天津師范大學種植園.在同一蘆葦濕地采集當年蘆葦葉片凋落物，共18份，風干至恒重（約20 d）.將每份樣品剪成1 cm×4 cm的條形并混勻，稱取5 g樣品裝入尼龍網袋中（網孔大小為1 mm×1 mm），每個栽培盆土壤表面中央放置1個裝有葉片凋落物樣品的尼龍袋（使樣品緊貼土壤表面）.

1.2 實驗設置

2019年11月1日開始進行模擬增溫和增氮交互實驗.模擬增溫實驗設置為常溫（AT）和增溫（WT）處理.常溫處理中，栽培盆放置于透明的避雨大棚中，保持良好通風，棚內溫度與環境溫度保持一致，實驗期間平均溫度為11.2℃.增溫處理中，栽培盆放置于透明的增溫溫室中，利用溫室效應進行增溫，室內溫度較常溫處理平均增溫2.3℃，實驗期間平均溫度為13.5℃.氮輸入水平分別設置為：13（N13）、20（N20）、40（N40）g/（m2·a）.共6個處理組合：AT×N13（A）、AT×N20（B）、AT×N40（C）、WT×N13（D）、WT×N20（E）、WT×N40（F）.將18盆土樣和蘆葦葉片凋落物樣品隨機分配到以上6個處理組合中，每個組合3個重復.實驗過程中，將栽培盆置于適當大小的水盆中（維持水深約3 cm），栽培盆中土壤通過透水孔吸收水分以保持穩定的水的質量分數（約30%，與天津濱海濕地土壤中水的質量分數基本相當）.根據氮輸入水平設置，每月在N13、N20和N40處理中的各栽培盆土壤表面均勻施加適量尿素.2020年6月30日，采集蘆葦葉片凋落物樣品，-20℃條件下保存.

1.3 實驗方法

1.3.1 土壤理化性質分析

采用烘干稱重法測定土壤中水的質量分數（SWC），采用酸度計法測定土壤pH值（土與水的質量比為1∶1），采用燃燒法測定土壤有機質含量（SOM），采用鹽度計法測定土壤鹽度（S），采用紫外分光光度法測定土壤總氮含量（TN）和硝態氮含量（NO3-），采用鹽酸萘乙二胺分光光度法測定土壤亞硝態氮含量（NO2-），采用靛酚藍比色法測定土壤銨態氮含量（NH4+），采用堿熔-鉬銻抗分光光度法測定土壤總磷含量（TP），采用鉬酸銨分光光度法測定土壤有效磷含量（AP）.

1.3.2 蘆葦凋落物分解細菌和真菌的分離與鑒定

采用經典稀釋涂布平板法，分析蘆葦凋落物中可培養細菌和真菌的群落組成.用牛肉膏蛋白胨培養基培養細菌，37℃條件下培養2~3 d；用孟加拉紅培養基培養真菌，28℃條件下培養3~5 d.通過預實驗確定適宜的稀釋倍數，使平板上菌落數量約為30~300個.對稀釋后的菌液進行涂布，用菌落計數器對不同形態的菌落進行計數，用平板劃線法將不同形態的菌落純化為單一形態的菌落.分別利用細菌和真菌基因組DNA提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）提取細菌和真菌的基因組DNA，以其為模板對特定片段進行PCR擴增.利用引物1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）和27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）擴增細菌16S rRNA基因片段，利用引物Geo A2（5′-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3′）和Geo11（5′-ACCTTGTTACTTTTACTTCC-3′）擴增真菌18S rRNA基因片段，產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，用BLAST程序（http：//blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對測序結果進行比對分析，鑒定到屬分類學水平.

1.4 數據處理

根據不同處理組中細菌和真菌的群落組成數據，分別計算細菌和真菌群落的Shannon-Wiener多樣性指數（H）和Simpson多樣性指數（D），公式如下：

式中：Pi表示群落中第i個物種的個體數占群落中個體總數的比例.

應用SPSS 19.0軟件對數據進行方差分析和Tukey HSD多重比較分析，用Origin Pro 2017軟件作圖.應用PAST 3軟件對微生物群落組成特征進行非度量多維尺度分析（NMDS）.應用Canoco 5軟件對微生物群落組成和土壤理化因子間相關關系進行冗余分析（RDA）.

2 結果與分析

2.1 不同溫度和氮輸入水平條件下土壤理化性質差異

不同溫度和氮輸入水平條件下，天津濱海濕地土壤的主要理化性質如表1所示.

表1 不同增溫和增氮條件下天津濱海濕地土壤主要理化性質Tab.1 Main properties of soil in Tianjin coastal wetland under different temperatures and nitrogen input levels

由表1可以看出，不同處理組中，土壤中水的質量分數和鹽度均差異均不具有統計學意義（P>0.05），表明增溫和增氮對二者沒有顯著影響.隨著氮輸入水平的增加，pH值呈下降趨勢，土壤有機質含量、總氮含量、銨態氮含量、硝態氮含量、亞硝態氮含量、總磷含量、有效磷含量均呈上升趨勢.隨著溫度增加，土壤有機質含量呈下降趨勢，銨態氮含量呈上升趨勢.

2.2 蘆葦凋落物可培養細菌和真菌的數量差異

在不同溫度和氮輸入水平條件下，天津濱海濕地蘆葦凋落物可培養細菌和真菌數量如圖1所示.

圖1 不同溫度和氮輸入水平條件下蘆葦凋落物可培養細菌和真菌數量Fig.1 Quantities of culturable bacteria and fungi of P.australis litter under different temperatures and nitrogen input levels

由圖1（a）可以看出，相同氮輸入水平條件下，增溫處理使細菌數量呈下降趨勢；相同溫度條件下，隨著氮輸入水平增加細菌數量呈先下降再上升的趨勢.由圖1（b）可以看出，隨著氮輸入水平的增加真菌數量呈先上升再下降的趨勢.

2.3 蘆葦凋落物可培養細菌和真菌的群落組成差異在天津濱海濕地蘆葦凋落物中分離得到可培養細

菌18個屬和真菌17個屬，群落組成如圖2所示.

圖2 不同溫度和氮輸入水平條件下細菌和真菌群落組成Fig.2 Community composition of culturable bacteria and fungi under different temperatures and nitrogen input levels

由圖2（a）可以看出，AT-N40處理組中細菌的菌屬豐富度最高（有15個屬），AT-N20處理組中菌屬豐富度最低（有8個屬）.不同溫度和氮輸入水平處理中均分布有芽孢桿菌屬（Bacillus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、節桿菌屬（Arthrobacter）、考克氏菌屬（Kocuria）、放線菌屬（Actinomycetes）和動性球菌屬（Planococcus）.芽孢桿菌屬、不動桿菌屬、假單胞菌屬和節桿菌屬在各處理組中均占有較高比例；而短雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、鏈球菌屬（Streptococcus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）僅出現在常溫處理中.由圖2（b）可以看出，WT-N13處理組中真菌的菌屬豐富度最高（有15個屬），WT-N20和WT-N40處理組中均有10個屬.在不同溫度和氮輸入水平處理中均分布有曲霉屬（Aspergillus）、多環孢霉屬（Ciclosporin）、木霉屬（Trichoderma）、頂頭孢屬（Cephalosporium）、青霉屬（Penicillium）、藍狀菌屬（Talaromyces）.紅孢菌屬（Catenulispora）和小不整球殼屬（Plectosphaerella）僅出現在常溫處理中；瑪麗亞霉屬（Mariannaea）僅出現在增溫處理中.

對不同溫度和氮輸入水平條件下蘆葦凋落物可培養細菌和真菌的群落組成進行NMDS分析，結果如圖3所示.

圖3 不同溫度和氮輸入水平條件下細菌和真菌群落組成的非度量多維尺度分析（NMDS，基于Bray-Curtis相異系數）Fig.3 Nonmetric multidimensional scaling analysis of bacteria and fungi community composition of under different temperatures and nitrogen input levels（NMDS，Based on Bray-Curtis dissimilarity）

由圖3可以看出，不同溫度和氮輸入水平處理間細菌群落和真菌群落的組成均存在明顯差異，表明增溫和增氮對蘆葦凋落物可培養細菌群落和真菌群落組成均有顯著影響.

2.4 蘆葦凋落物可培養細菌和真菌的群落多樣性差異不同溫度和氮輸入水平條件下蘆葦凋落物可培

養細菌和真菌的群落多樣性如圖4所示.由圖4（a）和圖4（b）可以看出，氮輸入水平為13 g/（m2·a）條件下，與常溫處理相比，增溫處理使細菌群落H指數和D指數均顯著上升（P<0.05）；氮輸入水平為20 g/（m2·a）條件下，常溫和增溫處理間細菌群落H指數和D指數差異不顯著（P>0.05）；氮輸入水平為40 g/（m2·a）條件下，增溫處理使細菌群落H指數和D指數顯著下降（P<0.05）.常溫處理條件下，細菌群落H指數和D指數均隨氮輸入水平增加而上升；增溫處理條件下，細菌群落H和D指數均隨氮輸入水平增加而下降.

由圖4（c）和圖4（d）可以看出，與常溫處理相比，增溫處理使真菌群落H指數和D指數呈下降趨勢.真菌群落H指數和D指數均隨氮輸入水平增加而下降.

圖4 不同溫度和氮輸入水平條件下細菌與真菌群落Shannon-Wiener和Simpson多樣性指數Fig.4 Community Shannon-Wiener diversity and Simpson diversity of bacterial and fungal communities under different temperatures and nitrogen input levels

2.5 蘆葦凋落物可培養細菌和真菌群落組成與土壤理化性質間的相關關系

不同溫度和氮輸入水平條件下，蘆葦凋落物可培養細菌和真菌群落組成與土壤理化性質間相關關系的冗余分析（RDA）結果如圖5所示，各土壤因子對細菌群落和真菌群落組成變異的解釋度如表2所示.

由圖5（a）可知，前2個RDA軸的特征值分別為0.388 2和0.129 1，對蘆葦凋落物可培養細菌群落組成變異的總解釋度為51.73%.微桿菌屬（Microbacterium）、鞘氨桿菌屬（Sphingomonas）、溶桿菌屬（Fusobacterium）、短桿菌屬（Brevibacterium）和葡萄球菌屬與土壤鹽度、有效磷含量、硝態氮含量、銨態氮含量呈正相關關系；不動桿菌屬、芽孢桿菌屬和節桿菌屬與土壤總磷含量呈正相關關系；諾卡氏菌屬（Nocardia）、紅球菌屬（Rhodococcus）、鏈球菌屬、假單胞菌屬、類芽孢桿菌屬和放線菌屬與土壤pH值呈正相關關系；動性球菌屬（Planococcus）、考克氏菌屬、伯克氏菌屬（Burkholderia）和短雙歧桿菌屬與土壤有機質含量、亞硝態氮含量、土壤中水的質量分數和總氮含量呈正相關關系.由表2可知，總體上對蘆葦凋落物可培養細菌群落組成起主導作用的土壤因子為土壤總磷含量（解釋度16.40%）、亞硝態氮含量（解釋度14.10%）和銨態氮含量（解釋度12.70%）.

由圖5（b）可知，前2個RDA軸的特征值分別為0.615 8和0.019 9，對蘆葦凋落物可培養真菌群落組成變異的總解釋度為63.58%.頂頭孢屬和鏈孢霉屬（Neurospora）與土壤中水的質量分數和鹽度呈正相關關系；交鏈孢屬（Alternaria）、瑪麗亞霉屬和曲霉屬與土壤有效磷含量、硝態氮含量、有機質含量和總氮含量呈正相關關系；多環孢霉屬、鐮刀菌屬（Fusarium）、青霉屬、帚枝霉屬（Sarocladium）、擬青霉屬（Paecilomyces）、毛霉屬（Mucor）和赤霉屬（Gibberella）與土壤pH值呈正相關關系；枝孢霉屬（Ramulispora）、小不整球殼屬、紅孢菌屬、藍狀菌屬和木霉屬與土壤總磷、銨態氮、亞硝態氮含量呈正相關關系.由表2可知，對蘆葦凋落物可培養真菌群落組成起主導作用的土壤因子為土壤亞硝態氮含量（解釋度16.70%）和pH值（解釋度12.40%）.

圖5 不同溫度和氮輸入水平條件下細菌和真菌群落組成與土壤理化性質間相關關系的冗余分析（RDA）Fig.5 Redundancy analysis（RDA）of the relationships between the bacterial and fungal community compositions and the main soil properties under different temperatures and nitrogen input levels

表2 冗余分析中各土壤因子對不同溫度和氮輸入水平條件下細菌和真菌群落組成變異的解釋度Tab.2 Explaining percentage of soil factors for the variations in the bacterial and fungal community compositions under different temperatures and nitrogen input levels in the redundancy analysis（RDA）

3 討論與結論

本研究通過模擬增溫和增氮控制交互實驗，探究增溫和增氮對天津濱海濕地蘆葦凋落物可培養細菌和真菌群落的影響.結果表明，增溫使細菌數量降低，可能是由于凋落物中細菌對增溫較為敏感.宋影等[7]、龐芳[8]的研究均表明，增溫可顯著抑制細菌數量.本研究中增溫對蘆葦凋落物可培養真菌數量無顯著影響，表明這些真菌類群可能對增溫有較強的耐受能力.這與譚成玉[9]、劉麗等[10]的研究結果一致.

總體上氮輸入水平的增加可使蘆葦凋落物可培養細菌數量降低，可能是因為增氮可引起土壤pH值降低，導致土壤酸化，從而使土壤的交換性Al3+含量升高，對細菌數量產生抑制作用[11].周世興等[12]研究發現，在森林生態系統中過量的外源氮輸入顯著降低了土壤細菌數量.本研究中蘆葦凋落物可培養真菌數量隨氮輸入水平的增加呈先上升再下降的趨勢，這表明較低的氮輸入水平可促進真菌數量的增加，而較高的氮輸入水平則會抑制真菌數量.這可能是由于中等氮輸入水平可促進土壤氮磷等營養物質的循環，為土壤真菌的生長提供了良好的條件；而較高的氮輸入水平可導致土壤酸化，增加Ca2+、Mg2+等陽離子的溶解與流失，土壤溶液中Al3+濃度增加，對真菌產生毒害作用[13].付智丹等[14]研究發現，適宜的施氮量可增加農田土壤中的真菌數量.周世興等[12]研究發現，過量的外源氮輸入對土壤真菌數量有顯著抑制作用.此外，有研究指出，土壤中外源氮輸入水平超過一定閾值后，土壤微生物群落由真菌占優勢逐漸轉變為細菌占優勢[15-16]，這也可能是本研究中在較高氮輸入水平條件下蘆葦凋落物可培

養真菌數量下降而細菌數量上升的原因.常溫條件下蘆葦凋落物可培養細菌多樣性指數隨氮輸入水平增加而上升，增溫條件下指數隨氮輸入水平增加而下降.Sun等[17]的研究表明，適量施氮可增加土壤細菌群落多樣性，過量施氮則使土壤細菌群落多樣性下降.Jennifer等[18]的研究表明，高氮沉降區土壤細菌群落多樣性較低.本研究進一步發現，增溫將強化較高氮輸入水平對細菌群落多樣性的負面影響.增溫處理使蘆葦凋落物可培養真菌群落的多樣性指數下降，可能是由于在增溫條件下，能耐受較高溫度的真菌類群更占優勢（如木霉菌屬、瑪麗亞霉屬），從而使真菌群落多樣性有所降低.這一結果與姚世庭[19]、Asma等[20]的研究結果一致.本研究中蘆葦凋落物真菌群落多樣性指數隨氮輸入水平的增加而下降，這可能是由于氮輸入的增加使土壤pH值下降，導致土壤酸化，從而使真菌多樣性降低[21].Yu等[22]、王春萍等[23]的研究也表明，增氮可使土壤真菌多樣性降低.此外，在較高氮輸入水平條件下，凋落物中可分泌抗生素的真菌類群（如木霉屬和青霉屬）的相對豐度有所增加，這也可能使對抗生素敏感的真菌類群受到抑制[24]，從而導致真菌群落多樣性下降.本研究表明，濱海濕地中凋落物分解真菌群落與土壤真菌群落對氮輸入水平的增加有相似的響應模式.

對蘆葦凋落物可培養細菌群落組成起主導作用的土壤因子為土壤總磷含量、亞硝態氮含量和銨態氮含量，對真菌群落組成起主導作用的土壤因子為土壤亞硝態氮含量和pH值.已有研究指出，亞硝態氮含量對土壤細菌和真菌群落組成均有重要影響[24-25].劉金良[26]的研究也表明，土壤磷含量可顯著影響植物根際細菌群落的結構和組成；劉紅梅[27]的研究顯示，pH值的改變可引起草原土壤真菌群落組成的顯著變化.本研究結果表明，增溫和增氮可改變濱海濕地土壤的理化性質，進而影響凋落物分解微生物群落的組成特征.

綜上所述，全球變暖和氮輸入水平的急劇增加將改變濱海濕地蘆葦凋落物分解微生物的群落組成，并降低其群落多樣性，這將導致濱海濕地凋落物分解微生物功能的降低，進而對濱海濕地物質循環產生不利影響.