細胞周期激酶抑制因子4基因座中反義非編碼RNA 在急性髓細胞性白血病中的表達及與患者臨床特征的關系

蔡莉莉，趙凱，王根杰

商丘市第一人民醫院1輸血科，2檢驗科，3血液科，河南 商丘 476100

急性髓細胞性白血病（acute myelogenous leukemia，AML）是一種起源于造血干細胞的惡性血液腫瘤，主要表現為髓系祖細胞增殖失調、浸潤、凋亡受阻，導致造血功能障礙[1-2]。AML主要表現為貧血、出血、感染等癥狀[3]。研究認為，基因異常和表觀遺傳學改變是AML發病機制中的重要環節[4-6]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類可調節基因表達的生物分子，參與染色體修飾、基因印記、細胞分化、細胞周期等生物學過程。不同的lncRNA通過不同機制在AML的發生發展過程發揮重要作用[7-8]。細胞周期激酶抑制因子4基因座中反義非編碼RNA（antisense non-coding RNA in the inhibitors of cyclin-dependent kinase 4 locus，ANRIL）是定位于人類染色體9p21的lncRNA，其表達異常與心血管疾病、腫瘤等密切相關[9-10]。ANRIL在AML中的報道較少，本研究探討ANRIL在AML發生發展過程中的作用，以進一步闡述AML的發生機制，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年6月至2021年5月商丘市第一人民醫院收治的AML患者。納入標準：①符合AML的診斷標準，均經細胞學、免疫學、遺傳學及分子生物學等檢查確診；②均接受化療，且均可耐受；③年齡≥18歲，復查時接受骨髓療效評價。排除標準：①合并其他惡性腫瘤、肝功能嚴重障礙、精神疾病或自身免疫性疾病；②合并凝血功能異常，對化療藥物過敏或存在藥物禁忌證。依據納入和排除標準，本研究共納入82例AML患者為研究對象，作為觀察組，其中男54例，女28例，中位年齡33歲。所有患者均給予柔紅霉素及或阿糖胞苷方案化療，依據患者病情分為初治組（n=53）、緩解組（n=19）和復發組（n=10）。初治依據法、美、英（France-America-British，FAB）診斷標準判定；緩解指化療后患者的骨髓原始和幼稚細胞比例＜5%；復發指化療后患者的骨髓原始細胞比例＞20%。另選取31例非血液病健康者，作為對照組，其中男18例，女13例；中位年齡36歲。兩組受試者性別、年齡比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經醫院倫理委員會審批通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

Prime Srcipt RT reagent kit逆轉錄試劑盒購自大連寶生物公司，Ultra SYBR Mixture購自康為世紀生物科技有限公司。CFX96熒光聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、GelDoc XR System凝膠成像系統均購自美國Bio-Rad公司。

1.3 單個核細胞提取

無菌條件下抽取所有受試者骨髓5 ml，置于含有乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）的抗凝管，1500 r/min離心5 min，取上層血漿于-80℃保存，下層加入2倍體積的生理鹽水混勻。另取裝有淋巴細胞分離液（Ficoll液）的離心管45°傾斜，緩慢沿離心管壁將含有生理鹽水的骨髓細胞加入至Ficoll液面上層，室溫2000 r/min離心30 min。此時細胞分為4層，小心吸取第2層白色層的單個核細胞，并加入等體積生理鹽水洗滌，1500 r/min離心5 min，重復3次，沉淀物即為單個核細胞。

1.4 實時PCR法檢測ANRILmRNA 的相對表達量

按照Trizon試劑盒提取單個核細胞的RNA，檢測細胞中的mRNA濃度和純度，然后合成互補DNA（complementary DNA，cDNA），以cDNA為模板，在熒光定量PCR儀上進行檢測，反應體系：無核糖核酸酶滅菌蒸餾水 9.5 μl、cDNA 1 μl、正向引物1 μl、反向引物1 μl、2×qPCR混合物12.5 μl；反應過程：95℃預變性10 min、95℃變性10 s、58℃退火30 s、72℃延伸30 s，共40個循環，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參，計算ANRILmRNA的相對表達量。引物序列：ANRIL正向引物5'-TCCATTTACCTGTGCGTGGC-3'，反向引物 5'-GAAGGAAGATTCGGCCACCT-3'；GAPDH正向引物 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反 向 引 物 5'-AACGCTTCAATTTGCGT-3'。

1.5 統計學方法

采用SPSS 24.0軟件對所有數據進行統計分析，正態分布計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ANRILmRNA 相對表達量的比較

觀察組、初治組、緩解組、復發組患者骨髓ANRILmRNA的相對表達量均明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。復發組患者骨髓ANRILmRNA相對表達量明顯高于緩解組和初治組，緩解組患者骨髓ANRILmRNA的相對表達量明顯低于初治組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表1）

表1 AML患者和非血液病患者骨髓ANRIL mRNA相對表達量的比較（±s）

表1 AML患者和非血液病患者骨髓ANRIL mRNA相對表達量的比較（±s）

注：a與對照組比較，P＜0.01；b與初始組比較，P＜0.01；c與緩解組比較，P＜0.01

組別觀察組（n=8 2）初治組（n=5 3）緩解組（n=1 9）復發組（n=1 0）對照組（n=3 1）F值P值2.9 5±0.2 8 a 2.8 5±0.3 2 a 1.5 4±0.1 1 a b 3.4 6±0.2 8 a b c 1.0 0±0.0 8 4 4 4.0 5 6 0.0 0 0 A N R I L m R N A相對表達量

2.2 不同臨床特征AML患者骨髓ANRILmRNA相對表達量的比較

不同年齡、性別、白細胞計數、血紅蛋白水平AML患者骨髓ANRILmRNA相對表達量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；血小板計數＜20×109/L、疾病進展、預后未緩解或緩解后再復發AML患者骨髓ANRILmRNA相對表達量分別明顯高于血小板計數≥20×109/L、疾病無進展、預后緩解患者，差異均有統計意義（P＜0.01）。（表2）

表2 不同臨床特征AML患者骨髓ANRIL mRNA相對表達量的比較（n=82）

3 討論

研究發現，RNA表達水平的變化有助于惡性腫瘤的診斷。人類基因組中僅有不超過2%的序列能夠編碼蛋白質，其他序列雖然不能編碼蛋白質，但超過90%的序列會轉錄成為RNA，此類RNA被稱為非編碼RNA，包括lncRNA。lncRNA是一類長度超過200個核苷酸、沒有明顯開放閱讀框、具有基因表達調節功能的生物分子。人類基因組中存在大量的lncRNA，能夠通過調節腫瘤細胞增殖、遷移、轉移等生物學功能影響腫瘤的發生發展過程[11]。

ANRIL主要定位于細胞核，由19個外顯子及3個重要抑癌基因簇反義方向轉錄形成3834 bp的mRNA上，可通過以下兩個途徑參與腫瘤的發生發展[10,12]：①ANRIL通過招募多梳抑制復合物（polycombrepressive complex，PRC）2介導組蛋白H3賴氨酸27的甲基化，進而抑制p15的轉錄，促進腫瘤細胞增殖。②ANRIL與分子伴侶CBX7相互作用，招募PRC1，介導組蛋白H3賴氨酸27甲基化，進而抑制p16蛋白的表達，促進腫瘤生長。ANRIL是引起動脈粥樣硬化性血管疾病的重要原因，在肺癌、胃癌、肝癌、子宮內膜癌等惡性腫瘤中均呈高表達[10]。

本研究采用實時PCR法檢測82例AML患者及31例非血液病健康者骨髓中ANRILmRNA的相對表達量，結果顯示，觀察組、初治組、緩解組、復發組患者骨髓ANRILmRNA的相對表達量均明顯高于對照組（P＜0.01），與ANRIL在其他腫瘤中的表達趨勢一致[12-13]，且Tan等[14]的研究表明，ANRIL在AML患者中高表達，且高表達ANRIL患者的OS更短。表明ANRIL可促進AML的發生發展。本研究結果顯示，復發組患者骨髓ANRILmRNA相對表達量明顯高于緩解組和初治組，緩解組患者骨髓ANRILmRNA的相對表達量明顯低于初治組。Sun等[15]的研究也表明，ANRIL在AML患者中高表達，療效評價為完全緩解后其相對表達量降低，且可通過抑制脂聯素的表達促進AML細胞存活，其作用機制可能通過調節脂聯素受體1/AMP依賴的蛋白激酶[adenosine 5’-monophosphate（AMP）-activated protein kinase，AMPK]/沉默信息調節因子1（silent information regulator 1，SIRT1）糖代謝通路有關。表明化療藥物的誘導刺激可促使ANRIL的表達上調。因此，AML患者治療過程中應加強ANRILmRNA水平測定，根據測定結果調整治療方案，使患者的治療更具科學性。

綜上所述，ANRIL在AML患者中高表達，其表達水平能反映患者的疾病嚴重程度，可指導臨床診療。