振腹環揉法對PCPA失眠大鼠腦、腸組織中SP及GAL蛋白表達的影響

郅曉宇，劉 鵬，董 娜，張 野，張紅石*

（1.長春中醫藥大學，長春 130117；2.長春中醫藥大學附屬醫院，長春 130021）

課題組在腹部推拿治療失眠的機制研究中，發現了臟腑推拿治療失眠存在腦腸互動現象，且與人體腦腸肽調節密切相關。因此，本研究通過前期實驗篩選，確定了兩種與睡眠密切相關的腦腸肽SP與GAL，通過Western blot檢測二者在下丘腦及小腸中的蛋白表達，驗證腹部推拿治療失眠存在腦腸互動現象。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物與分組

64只SPF級雄性Wistar大鼠，由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供[動物許可證號：SCXK（吉）-2020-0002]，7周齡，體質量（200±20）g左右。大鼠隨機分成空白組、模型組、推拿組、藥物組，每組16只。

1.2 實驗材料

戊巴比妥鈉（Merck公司），PCPA（美國Sigma公司），戊巴比妥鈉（國藥集團化學試劑有限公司），碳酸氫鈉（成都市科龍化工試劑廠），阿拉伯膠（天津市光復精細化工研究所），RIPA裂解液（碧云天生物技術公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術公司），PBS磷酸鹽緩沖液（北京中杉金橋生物技術有限公司），人參歸脾丸（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠）。

1.3 實驗儀器

電泳系統（型號：Mini-ProteanTetra，美國Bio-Red公司），轉膜儀（型號：170-4150，美國Bio-Rad公司），成像分析系統（型號：FluorChemQ，美國Proteinample公司），離心機（ESCO MCR-88-8）。

2 方法

實驗方案經長春中醫藥大學動物實驗倫理審查委員會審核通過（No：2021248），具體方法如下。

2.1 PCPA失眠模型大鼠制作

將加入阿拉伯膠的PCPA粉末研磨至泡沫狀，以氯化鈉溶液和碳酸氫鈉溶液配制成100 mg·mL-1混懸液，備用，于注射前震蕩搖勻。模型組、推拿組以及藥物組采用PCPA腹腔注射制作失眠大鼠模型，大鼠適應性飼養1周后，按大鼠體質量400 mg·mL-1計算PCPA使用量。每日上午8:00－10:00時對大鼠進行腹腔注射，每日1次，連續注射2 d。以30 mg·mL-1戊巴比妥鈉進行腹腔注射對造模后大鼠進行翻正反射實驗，記錄翻正反射消失時間與睡眠持續時間，如與空白組出現統計學差異（P＜0.05），則證明模型復制成功。

2.2 干預方法

1）空白組：不做任何處理。2）模型組：造模成功后正常飼養。3）推拿組：造模成功后行振腹環揉治療，將每只大鼠套裝于干凈襪子中，以震動按摩器環揉腹5 min，并以震動按摩器于腹部振動5 min，每日1次，連續治療5～10 d。4）藥物組：按照人:大鼠=1:30的比例灌服人參歸脾丸（將藥物劑量按照體質量轉化為毫升數），連續5～10 d。

2.3 實驗動物取材

治療5 d后每組處死8只大鼠，治療10 d后處死剩余大鼠。使用異氟烷進行氣麻后進行斷頭處理，在冰盤上剝離下丘腦，并迅速放入液氮中；截取小腸5 cm，于預冷過的生理鹽水中清洗后，立即放入-80 ℃冰箱保存。

2.4 Western blot測定

1）取大鼠下丘腦以及小腸組織，稱重后加入預冷的RIPA 裂解緩沖液研磨。2）4℃ 12 000 r·min-1，離心15 min，提取上清液。3）BCA檢測法測蛋白濃度。4）聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據各目的蛋白從SDS聚丙烯酰胺凝膠轉移PVDF膜。5）5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入一抗后過夜。6）將取出的膜在PBS溶液中洗滌5 min，重復3次，隨后將膜放入封閉的盒子中，加入合適濃度的二抗，室溫孵育1 h。7）將β-actin作為內參，化學發光法顯影，觀察拍照。8）采用Image Pro Plus圖像分析軟件測算出SP、GAL蛋白表達條帶的光密度值，進行蛋白表達水平分析。

2.5 統計學方法

數據使用SPSS 22.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差（±s）表示，組間多重比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組翻正反射實驗

見表1。

表1 各組造模后翻正反射消失時間及睡眠持續時間比較（±s，n = 16）min

表1 各組造模后翻正反射消失時間及睡眠持續時間比較（±s，n = 16）min

注：與空白組比較，# P＜0.05

組別 翻正消失時間 睡眠持續時間空白組 5.12±0.39 35.01±0.86模型組 10.18±0.84 # 22.15±0.21 #推拿組 10.18±0.76 # 23.22±0.43#藥物組 10.16±0.69 # 23.92±0.11 #

3.2 各組蛋白水平變化

振腹環揉法干預后，各組蛋白印跡圖（見圖1）；大鼠下丘腦中GAL的蛋白表達量上升（見表2、圖2），小腸中GAL的蛋白表達量下降（見表3、圖3）；下丘腦、小腸中SP的蛋白表達量上升（見表2、表3、圖2、圖3）。

圖1 各組蛋白印跡圖

圖2 下丘腦中SP、GAL蛋白表達量

圖3 小腸中SP、GAL蛋白表達量

表2 各組下丘腦SP、GAL蛋白水平變化比較（±s ）pg·mL- 1

表2 各組下丘腦SP、GAL蛋白水平變化比較（±s ）pg·mL- 1

注：與模型組第5天比較，# P＜0.05；與模型組第10天比較，△P＜0.05

組別 n SP GAL空白組第5天 16 1.52±0.14# 0.81±0.10 #模型組第5天 16 0.86±0.15 0.44±0.08推拿組第5天 16 1.06±0.24 # 0.58±0.04 #藥物組第5天 16 1.09±0.21 # 0.57±0.10 #空白組第10天 8 1.51±0.21△ 1.06±0.07△模型組第10天 8 1.10±0.20 0.50±0.07推拿組第 10 天 8 1.21±0.15 0.73±0.08 △藥物組第 10 天 8 1.24±0.10 0.71±0.06 △

表3 各組小腸SP、GAL蛋白水平變化比較（±s ）pg·mL- 1

表3 各組小腸SP、GAL蛋白水平變化比較（±s ）pg·mL- 1

注：與模型組第5天比較，# P＜0.05；與模型組第10天比較，△P＜0.05

組別 n SP GAL空白組第5天 16 0.35±0.02# 1.40±0.19 #模型組第5天 16 0.17±0.02 3.86±0.28推拿組第5天 16 0.24±0.01 # 2.33±0.15 #藥物組第5天 16 0.26±0.03 # 2.58±0.23#空白組第10天 8 0.36±0.01 △ 1.44±0.15 △模型組第10天 8 0.27±0.01 3.17±0.27推拿組第10天 8 0.32±0.01 △ 1.69±0.29 △藥物組第10天 8 0.34±0.01 △ 1.72±0.27 △

4 討論

現代神經生物學與心理學觀點認為，失眠與大腦的生理功能改變，遺傳因素及情感因素密切相關[1]。隨著神經生物學的發展，很多神經肽類物質被發現參與了睡眠—覺醒調節[2]，如神經肽Y（NPY），SP，膽囊收縮素（CCK）等，它們統稱為腦腸肽。作為既存在于腦中又存在于腸道中的雙重分布肽類[3]，目前已被發現60余種，大致分為神經肽、胃腸肽、胃腸神經肽3類[4]。腦腸肽在大腦與胃腸之間起著雙向調節作用，與睡眠—覺醒的調節有關[5]，是證明腹部推拿治療失眠存在腦腸互動現象的首選物質。腦腸肽是腦腸軸的橋梁性介質，在中樞神經系統和腸神經系統相互作用中起到雙向調節作用，其整合了腸道和大腦之間的神經、激素和免疫信號[6]。因此，微生物—腸道—大腦軸（microbiota-gut-brainaxis，MGBA）的確立[7]，為腹部推拿治療失眠的機制研究開辟了新的研究思路。

SP可以通過神經激肽受體發揮作用，從而改變非快速眼動（NREM）睡眠，因此靶點在其受體的藥物可以被用作睡眠醫學的新療法[8]。SP是神經激肽-1受體（NK-1R）的主要配體，遍布了包括皮層在內的整個大腦。NK-1R存在于睡眠活躍的皮質神經元上，其活性與慢波睡眠相關[9]。SP在外周主要存在于交感神經末梢，其變化水平可以在一定程度上反映中樞的變化[10]。它與胃腸運動密切相關，當胃腸運動受到抑制時，機體會分泌大量的SP來促進胃腸運動[11]。

GAL與睡眠、認知、情感行為等密切相關[12]。其主要存在于延髓腹側表面、孤束核、三叉神經尾核等。GAL可與DA、5-HT、NE等腦區神經遞質共存，對神經活動具有較強的調節功能[13]。腹外側視前區在慢波睡眠的維持和產生中具有重要作用，有研究發現存在于腹外側視前區的甘丙肽能神經元通過表達結節乳頭體核組胺能神經元上的GalR1增加慢波睡眠[14]。GAL在消化道中也有分布，對消化道具有調控作用，它可以抑制胃酸的分泌以及抑制進食后的胃部運動，并且對小腸的收縮活動具有抑制作用[15]。

本實驗結果顯示，振腹環揉法干預后，PCPA失眠大鼠下丘腦及小腸中SP表達量均升高，表明振腹環揉法提高了兩個部位的SP蛋白活性，促進了SP維持睡眠慢波狀態的生理作用，促進了胃腸運動。而GAL在下丘腦內表達升高，在腸道內表達下降，表明腹部推拿對不同部位的GAL表達調控出現了差異性。其可使下丘腦內GAL蛋白活性升高，維持睡眠周期內腦電波慢波效應，使腸道內GAL蛋白活性下降，改善胃腸道的抑制狀態。振腹環揉法通過調節PCPA失眠大鼠SP及GAL的表達，改善失眠大鼠睡眠狀態及腸道蠕動，這種現象驗證了腹部推拿治療失眠存在腦腸互動現象。