千金消澼液對腸黏膜上皮屏障緊密連接蛋白的影響

谷佰健，陳碧心，周建華*

（1.長春中醫藥大學，長春 130117；2.吉林省衛生健康信息中心，長春 130061）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種累及結直腸的慢性非特異性免疫性疾病，是炎性癥腸病的一種。主要表現為腸黏膜上皮結構破壞形成潰瘍，繼而出現黏液膿血便等癥狀，腸上皮緊密連接（tight junction, TJ）破壞與UC的發病密切相關。千金消澼液（QJXP）是一種能促進黏膜愈合，保護腸黏膜的中藥灌腸劑，臨床效果良好，在前期研究中發現，QJXP能減少三硝基苯磺酸誘導的結腸組織中嗜中性粒細胞和淋巴細胞，漿細胞的含量[1]，但其對腸粘膜保護機制尚不明確。現通過觀察QJXP對腸黏膜上皮屏障TJ作用，豐富QJXP治療UC的理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞

人結腸腺癌細胞Caco-2由吉林省酵母表達蛋白質藥物研發重點實驗室提供。

1.2 藥物與試劑

千金消澼液組成為白及10 g，白蘞10 g，白芷10 g，當歸10 g，防風10 g，白礬5 g，白芷、當歸、防風三味提取揮發油，剩余藥渣與白及、白蘞加水煎煮提取，當藥液溫度降至60 ℃時加入白礬，加水定容至50 mL，攪拌混勻。原液相當于生藥1.1 g·mL-1，將原液加入0.1%羧甲基纖維素鈉促溶，充分超聲震蕩，多次離心后取上清溶液，0.22 μm濾膜過濾，以2%FBS的DMEM培養基稀釋至1 g·mL-1母液；柳氮磺吡啶（salazosulfapyridine，SASP）依據上述方法分別配置成20 mmol·L-1母液，4 ℃密封避光保存備用。

Pierce蛋白酶和磷酸酶抑制劑微型片劑（Thermo fisher A32961）、放射免疫沉淀實驗(RIPA)裂解液（碧云天P0013B）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（Thermo fisher 23225）、CCK-8試劑盒 （博士德C0038）、Zo1/Occludin/Claudin-1抗體（Abcam BLR092G/EPR20992/EPRR18871）、羊抗兔二抗/羊抗鼠二抗 (博士德 BST15H06/A15I54）。

1.3 細胞培養

Caco-2自-80℃液氮中取出后迅速置入37℃恒溫水浴箱中解凍，解凍后在無菌條件下將細胞移入含有20%胎牛血清（FBS）的DMEM完全培養基中，轉移至37℃5%CO2孵箱中，隔日更換為含有10%FBS的DMEM培養基，根據細胞生長情況每24 h～36 h換液1次，當細胞生長至70%～80%時使用0.25%胰酶消化液消化傳代。

1.4 CCK-8法細胞活性檢測

取對數生長期的Caco-2進行96孔板鋪板，每孔約5×103，待細胞貼壁24 h后，培養基更換為2%FBS的DMEM培養基加入藥物QJXP致終濃度為200.0 mg·mL-1、100.0 mg·mL-1、50.0 mg·mL-1、10.0 mg·mL-1、5.0 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1；以及依據文獻[2]選取SASP為2.0 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1濃度進行檢測，每組設3個副孔，空白孔以等體積生理鹽水填充。培養24 h后，棄去培養基，加 DMEM100 μL 以及 CCK-8溶液 10 μL，37 ℃孵育1 h，酶標儀OD 450 nm檢測吸光度。根據細胞活力計算公式[3]計算細胞活性，選取接近正常細胞活性的藥物濃度進行后續實驗。

1.5 實驗設計

Caco-2細胞接種至25 cm 2flask中，每瓶約5×105個，培養48 h后，分為NC組、LPS組、SASP組、QJXP 5.0 mg·mL-1組、QJXP 2.5 mg·mL-1組、QJXP1.0 mg·mL-1組，Caco-2為人結腸細胞，單層培養時具有近似于結腸上皮的細胞極性和緊密鏈接[4]，此時將培養基更換為含有2%FBS的DMEM培養基，并分別加入3個濃度的QJXP或SASP溶液，預保護1 h后[5]，加入LPS 10 μg·mL-1[6]，24 h后終止實驗。

1.6 Western-bolt法蛋白含量檢測

提取1.5中的細胞總蛋白，經BCA蛋白定量后蛋白濃度調整至2 mg·mL-1，恒溫金屬浴蛋白變性后進行Western-bolt法檢測目的蛋白含量，各抗體稀釋比例參照說明書。以Photoshop對條帶背景進行處理，利用Image J圖像分析軟件對目的條帶分析各蛋白灰度值，以GAPDH作為內參蛋白計算各蛋白相對含量。

圖 1 QJXP可改善各TJ蛋白相對含量

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 不同濃度藥物對Caco-2細胞活力的影響

本實驗檢測了QJXP、SASP不同濃度對于Caco-2細胞活力的影響，結果見表1。選取最接近正常細胞活力的藥物濃度進行后續實驗，QJXP濃度為 5.0 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1，SASP濃度為1 mmol·L-1，SASP濃度的選取也與之前的研究相符合[2]。

表1 各藥物對Caco-2細胞活力的影響（±s，n = 3）

表1 各藥物對Caco-2細胞活力的影響（±s，n = 3）

組別 藥量/mg·mL-1 細胞存活率/%QXJP/mg·L-1 200.0 24.08±1.17 100.0 26.56±5.36 50.0 94.01±7.75 10.0 92.01±1.19 5.0 92.72±7.22 2.5 88.61±6.94 1.0 109.07±3.46 SASP/mmol·L-1 2.0 94.28±5.30 1.0 98.81±3.80 0.5 107.45±4.52 0.1 110.41±6.40

2.2 千金消澼液對于TJ蛋白Zo-1、Ocludin、Claudin-1的影響

QJXP對 TJ蛋 白 Zo-1、Occludin、Claudin1的影響與 NC組比較，LPS組 Zo-1、Occludin、Claudin-1蛋白水平顯著降低（均P＜0.05），證明建模成功。與SASP組比較，QJXP 2.5 mg·mL-1組Zo-1、Occludin、Claudin-1蛋白水平無顯著差異（P＞ 0.05）；QJXP 1.0、5.0 mg·mL-1組 Zo-1、Occludin、Claudin-1蛋白水平均顯著降低（P＜0.05）。見表2。表明QJXP 2.5 mg·mL-1與SASP對Zo-1、Occludin、Claudin-1的影響等效。

表2 TJ蛋白各組間相對含量（±s，n = 3）

表2 TJ蛋白各組間相對含量（±s，n = 3）

注：與NC組比較，# P＜0.05；與SASP組比較，△P＜0.05

組別 Zo-1 Occludin Claudin-1 NC 組 0.67±0.10 0.81±0.12 0.85±0.12 LPS 組 0.49±0.08#0.52±0.08#0.66±0.10#SASP 組 0.96±0.18 1.13±0.21 1.26±0.23 QJXP 5.0 mg·mL-1組 0.57±0.09△ 0.38±0.06△ 0.88±0.14△QJXP 2.5 mg·mL-1組 0.86±0.09 0.91±0.09 1.03±0.10 QJXP 1.0 mg·mL-1組 0.67±0.10△ 0.76±0.11△ 0.83±0.12△

3 討論

炎癥性腸病的發生主要涉及三種因素影響，包括先天免疫和自噬，這與克羅恩病（Crohn’s disease，CD）密切相關；其次是自適應免疫，在UC、CD的疾病發展有密切聯系；最后是腸黏膜屏障功能這在UC的早期疾病發展中起重要作用[7]。黏膜屏障分為4種[8]，包括機械屏障、化學屏障、免疫屏障及生物屏障。黏膜屏障結構完整則是發揮其免疫防御功能的先決條件[9]，一旦黏膜屏障結構破壞，腸后黏膜通透性升高，會誘導黏膜固有層免疫應答的發生，炎癥又會加重黏膜屏障的損壞[10]。機械屏障是腸黏膜屏障的重要組成部分，而腸上皮緊密連接TJ是機械屏障的基礎。緊密連接蛋白包括咬合蛋白（Occludin）、閉合蛋白（Claudins）、連接黏附分子（JAMs)以及3種閉合小環蛋白（ZOs）[11]。研究[12]表明在UC患者的腸黏膜中，腸道隱窩內的祖細胞和杯狀細胞的細胞群出現離散，胞內線粒體與內質網結構損壞，上述TJ分泌減少等異常。

千金消澼液為周建華教授根據中醫“久病入絡”“久病多瘀”理論創立的自擬方，方中白及、白蘞收斂止血，斂瘡生肌共為君。當歸補血活血止痛，白芷活血排膿，生肌止痛，二者共奏活血止痛之功，即可化腸絡之瘀阻，又可緩急止痛。白礬性寒味酸澀，酸可止血斂瘡，澀可澀腸止瀉，以助君藥。防風為治風之要藥，善治腸風下血，又引諸藥入脾經。現代藥理分析表明白及、白蘞等的主要成分對UC，尤其是促進黏膜愈合均有良好作用[13-17]。

綜上所述，2.5 mg·mL-1的千金消澼液能通過提高Zo-1、Occludin、Claudin-1含量進而保護腸黏膜上皮屏障，從而達到治療UC的目的。且效果與SASP無顯著差異。