“自身清”雙向調節JAK2/STATs信號通路抑制系統性紅斑狼瘡小鼠肺間質病變的研究?

談欣怡， 譚奚揚， 曹左媛， 陳曉云

(上海中醫藥大學附屬龍華醫院， 上海 200032)

系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種自身免疫應答異常，多種自身抗體產生累及多器官多系統的免疫疾病，女性的發病率為男性的10倍[1]。肺臟是SLE常易侵犯的器官，其中間質性肺病(interstitial lung disease，ILD)發病率高達50%，是SLE的主要并發癥之一[1]。目前SLE-ILD的發病機制尚不明確，且缺乏有效的治療藥物。有研究表明，酪氨酸激酶2/信號傳導與轉錄激活子(janus kinase 2/signal transducer and activator of transcriptions，JAK2/STATs)信號通路可以刺激輔助性T細胞17(helper T cells 17，Th17)分化，誘導多種炎癥細胞因子釋放，促進肺纖維化[1]。因此，糾正Th17和調節性T細胞(regulatory T cell，Treg)平衡可能具有改善SLE-ILD的作用。中醫藥治療ILD具有一定的優勢，已成為近年來研究的熱點[2，3]。上海市名中醫陳湘君教授根據SLE肝腎虧虛、熱毒內蘊的基本病機研發出經驗方“自身清”，治療SLE及其并發癥效果顯著[4-6]。前期研究發現，該方具有控制炎癥、調節細胞免疫等作用[7-9]，臨床發現其對抑制SLE-ILD有良好效果。本研究通過觀察“自身清”對SLE-ILD模型小鼠肺組織病理學、Th17/Treg平衡及白細胞介素17A(interleukin-17A，IL-17A)、 轉化生長因子(transforming growth factor-β1，TGF-β1)表達水平影響，探討其對SLE-ILD抗炎及抗纖維化作用機制，為今后治療SLE-ILD提供依據。本研究通過上海中醫藥大學附屬龍華醫院實驗動物倫理委員會批準(批號LHERAW-19011)。

1 材料

1.1 動物

SPF級11周齡雌性MRL/lpr小鼠40只和MRL/MpJ小鼠8只，體質量20～23 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，實驗動物許可證號SCXK(滬)2017-0005。飼養于上海中醫藥大學附屬龍華醫院SPF級實驗動物中心，溫度(23±3) ℃，相對濕度35%～45%，光照12 h晝夜循環，自由攝食飲水。

1.2 藥物

“自身清”組成：黃芪15 g，白術6 g，白芍15 g，地黃15 g，山茱萸9 g，白花蛇舌草15 g，牡丹皮15 g，丹參15 g，青蒿15 g，赤芍15 g，制何首烏12 g，甘草5 g，重樓15 g，由上海中醫藥大學附屬龍華醫院新藥顆粒劑藥房提供并制備。枸櫞酸托法替布片(批號CG3062)尚杰，規格5 mg/片，由輝瑞公司提供。

1.3 主要試劑

蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、BeyoECL Star(特超敏ECL化學發光試劑盒)，均購自上海碧云天生物技術有限公司(貨號分別為C0105 S、P0010 S、P0013B、P1046、P0012 AC、P0018 AS)；改良馬松(Masson)三色染色試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司(貨號G1346)；JAK2抗體、磷酸化JAK2(phosphorylated-JAK2，P-JAK2)抗體、STAT3抗體、磷酸化STAT3(phosphorylated-STAT3，P-STAT3)抗體、STAT5抗體、磷酸化STAT5(phosphorylated-STAT5，P-STAT5)抗體，均購自CST公司(貨號分別為3230、4406、30835、9145、94205、9359)；叉頭狀螺旋轉錄因子3 (fork-head box p3,Foxp3)抗體、維甲酸相關核孤兒受體γt(retinoid-associated orphan receptor γt，RORγt)抗體，購自英國Abcam公司(貨號分別為ab215206、ab207082)；小鼠IL-17A高敏ELISA試劑盒、人/小鼠/大鼠TGF-β1 ELISA試劑盒，購自杭州聯科生物技術股份有限公司(貨號分別為70-EK217HS-96、70-EK981-96)。

1.4 儀器設備

多樣品組織研磨機(上海凈信科技有限公司，型號Tissuelyser-24)；PowerPac 基礎電泳儀、Mini-PROTEAN Tetra電泳槽、小型Trans-Blot轉印槽(伯樂生命醫學產品有限公司，型號分別為164-5050、165-8001、170-3930)；凝膠成像系統(上海勤翔科學儀器有限公司，型號CHEMISCOPE 6300)；離心機(德國Eppendorf公司，型號5242R)；全自動組織脫水機、組織包埋機、輪轉切片機、組織攤片機(德國Leica公司,型號分別為TP1020、EG1150、RM2235、H11210)；正置顯微鏡(日本Nikon公司，型號ECLIPSE Ci)；酶標儀(美國伯騰儀器有限公司，型號Synergy H1MF)。

2 方法

2.1 分組與干預

適應性喂養1周后，隨機抽取2只MRL/lpr小鼠肺組織行HE和Masson染色，驗證模型建立。將40只MRL/lpr小鼠按體質量隨機分為模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、托法替布組每組8只，另將8只MRL/MpJ小鼠作為野生型對照組。中藥根據實驗動物與人體表面積折算[10，11]，即單位體質量小鼠日給藥劑量為單位體質量成人日處方量的9.1倍作為中劑量組小鼠日灌胃劑量，高劑量組為中劑量組2倍，低劑量組為中劑量組0.5倍。以蒸餾水溶解，最終制備成濃度為0.962 g/(kg·d)、1.925 g/(kg·d)、3.849 g/(kg·d)濃縮液，即低、中、高劑量組給藥濃度。以蒸餾水溶解托法替布，配制成終濃度為10 mg/(kg·d)的混懸液。模型組和野生型對照組給予0.9%氯化鈉溶液灌胃。各組小鼠每日灌胃1次，每次灌胃體積為0.2 mL/20 g，連續灌胃4周。

2.2 樣本采集

以2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠后打開小鼠胸腔，用0.9%氯化鈉溶液進行心臟灌注。完成灌注后，取小鼠左肺葉置于4%多聚甲醛中固定，常溫固定48 h，備石蠟切片用。取小鼠右肺上葉、中葉分別放入事先分組標記好的凍存管中，-80 ℃備用。

2.3 病理學染色

取小鼠固定后的左肺葉行石蠟包埋并切片，切片厚度4 μm，每組各取4只小鼠分別進行HE和Masson染色，中性樹膠封片，晾干后置于顯微鏡下觀察拍照。

2.4 蛋白免疫印跡

每組各取4只小鼠-80 ℃冰箱中保存右肺上葉組織，20 mg加入100 μL裂解液，并按照說明書加入一定量的PMSF和蛋白酶磷酸酶抑制劑，勻漿后取上清，BCA法測定蛋白濃度。取待檢測蛋白樣品上樣量30 μg電泳、轉膜、封閉、洗膜。將膜放入孵育盒中分別加入兔源一抗P-STAT3(1∶2000)、STAT3(1∶1000)、P-JAK2(1∶1000)、JAK2(1∶1000)、P-STAT5(1∶1000)、STAT5(1∶1000)、Foxp3(1∶1000)、RORγt(1∶1200)和β-actin(1∶2000)，4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h。洗膜后加入化學發光檢測試劑，用凝膠成像系統顯影分析。

2.5 ELISA檢測

每組各取4只小鼠右肺中葉組織50 mg，按照ELISA試劑盒說明書測定肺組織中IL-17A和TGF-β1含量。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 “自身清”對MLR/lpr小鼠肺臟組織病理學影響

圖1示，HE和Masson染色顯示，野生型對照組MRL/MpJ小鼠肺組織結構完整，肺泡結構正常，未見淋巴細胞浸潤和膠原纖維沉積。模型組和“自身清”低劑量組小鼠肺組織結構明顯破壞，肺泡結構紊亂，肺泡壁斷裂，肺泡間隔明顯增寬，伴大量淋巴細胞浸潤，膠原纖維沉積，部分可見肺實變。“自身清”中、高劑量組和托法替布組小鼠肺組織結構部分破壞，肺泡結構較紊亂，少量肺泡壁斷裂，肺泡間隔部分增寬，淋巴細胞浸潤和膠原纖維沉積較模型組和“自身清”低劑量組減少。

圖1 各組小鼠肺組織HE和MASSON染色病理結果比較(×200)

3.2 “自身清”對各組小鼠肺組織JAK2/STATs信號通路相關蛋白的影響

表1圖2示，與野生型對照組比較，模型組小鼠肺組織中p-STAT3、p-STAT5蛋白相對表達顯著降低(P<0.05)，p-JAK2、RORγt、Foxp3蛋白相對表達顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，“自身清”低、中、高劑量組小鼠肺組織中p-STAT3、p-JAK2、RORγt蛋白相對表達顯著降低(P<0.05)，p-STAT5、Foxp3蛋白相對表達顯著升高(P<0.05)；托法替布組小鼠肺組織p-STAT3、p-JAK2、RORγt蛋白相對表達顯著降低(P<0.05)。與托法替布組比較，“自身清”低劑量組小鼠肺組織中p-STAT5、Foxp3蛋白相對表達顯著升高(P<0.05)。

表1 各組小鼠肺組織p-JAK2、p-STAT3、p-STAT5、RORγt、Foxp3蛋白表達結果

3.3 “自身清”對各組小鼠肺組織細胞因子IL-17A和TGF-β1含量的影響

表2示，與野生型對照組比較，模型組小鼠肺組織中IL-17A含量顯著升高(P<0.05)，TGF-β1含量顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，“自身清”低、中、高劑量組和托法替布組小鼠肺組織中IL-17A含量顯著降低(P<0.05)，TGF-β1含量顯著升高(P<0.05)。

表2 各組小鼠肺組織細胞因子IL-17A和TGF-β1水平比較

4 討論

SLE-ILD是繼發于SLE的一種以肺部慢性炎癥及肺纖維化為主要病理改變的疾病。根據臨床表現，其屬于中醫學“肺痹”“肺痿”等范疇。SLE日久，素體虧虛，濕熱與熱毒久伏于內侵襲肌表，流注筋骨關節發為五體痹。五體痹者易受外邪侵襲，若風寒濕等邪氣雜至，外邪引動伏邪則致病情進展，五體之痹內舍于肺發為肺痹。肺痹日久，耗傷肺陰致使“肺熱葉焦”，肺葉萎弱不用發為“肺痿”[12]，其病機總屬本虛標實，肺腎虧虛為本，肺絡痹阻、痰瘀互結為標。前期研究已發現，“自身清”中方藥組成通過益氣、活血、化瘀等作用可以有效治療風濕性肺間質病變[13]。

注：A.野生型對照組；B.模型組；C.低劑量組；D.中劑量組；E.高劑量組；F.托法替布組；磷酸化STAT3(phosphorylated-STAT3，p-STAT3)，磷酸化JAK2(phosphorylated-JAK2，p-JAK2)，磷酸化STAT5(phosphorylated-STAT5，p-STAT5)，叉頭狀螺旋轉錄因3(fork-head box p3,Foxp3)，維甲酸相關核孤兒受體γt(retinoid-associated orphan receptor γt，RORγt)圖2 各組小鼠肺組織p-JAK2、p-STAT3、p-STAT5、RORγt、Foxp3免疫印跡條帶

自身免疫性疾病MRL/MpJ小鼠及其Faslpr基因敲除MRL/lpr小鼠組織病理學及血清學表現與人SLE發病相似，常用于SLE及其相關疾病研究。與MRL/MpJ小鼠比較，MRL/lpr小鼠因Faslpr基因突變，抑制T淋巴細胞凋亡，加速小鼠免疫損傷形成和進展[14，15]。且已有研究發現，MRL/lpr小鼠在8周齡時肺泡壁出現淋巴細胞浸潤，14周齡發生嚴重肺纖維化[16]，其ILD的發生相較于其他肺纖維化小鼠模型更符合SLE-ILD發病機制。因此，本實驗選用MRL/lpr小鼠作為模型鼠，MRL/MpJ作為野生型對照組。本實驗結果發現，12周齡MRL/MpJ小鼠肺組織結構完整，肺泡壁連續未見淋巴細胞浸潤；MRL/lpr小鼠肺組織已出現肺泡結構紊亂，肺泡間隔增寬，大量淋巴細胞浸潤，部分膠原纖維沉積等病理表現，基本符合SLE-ILD病理表現，說明模型成功。在本實驗中，經“自身清”治療后小鼠肺組織肺泡炎癥及肺纖維化明顯減輕，并具有劑量依賴性，提示“自身清”可以減少SLE-ILD小鼠肺組織炎癥細胞浸潤，促進肺組織修復，延緩肺纖維化進程，說明“自身清”對SLE-ILD具有一定的治療作用。

SLE-ILD的發生與自身免疫系統紊亂密切相關[17]，其中JAK2/STATs信號通路介導Th17/Treg失衡是其發病機制之一。生理狀態下，Th17/Treg處于動態平衡狀態，維持機體免疫穩態。當肺組織損傷時，炎癥因子IL-6聯合TGF-β激活JAK2/STAT3信號通路，促使CD4+T細胞向CD4+Th17細胞分化，增加IL-17分泌，誘導上皮細胞凋亡、纖維細胞活化和增生、膠原蛋白沉積，加速肺纖維化進展[18，19]。Chen[20]等研究發現，在病原體攻擊肺組織時，Th17細胞可以分泌大量IL-17A，加重肺組織損傷，導致肺纖維化形成。獨立存在的TGF-β可以誘導CD4+T淋巴細胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞分化[21]。IL-2亦可聯合TGF-β激活STAT5,誘導CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的分化[22]。當機體Treg細胞占優勢時，可以抑制Th17的分化及炎癥反應，延緩ILD進程[23]。由此可見，單一抑制Th17細胞分化或促進Treg細胞分化并不是控制CTD-ILD的最佳途徑，糾正Th17/Treg失衡狀態才是治療CTD-ILD的關鍵。

本實驗結果發現，經“自身清”治療后小鼠肺組織中p-JAK2、p-STAT3、RORγt蛋白表達呈劑量依賴性降低，p-STAT5、Foxp3蛋白表達明顯升高，低劑量組尤甚，且IL-17A水平明顯低于模型組，TGF-β1水平明顯高于模型組，表明“自身清”對SLE-ILD小鼠肺組織中JAK2/STAT3信號通路具有抑制作用，減輕肺部炎癥及纖維化；此外“自身清”可以活化STAT5/Foxp3相關信號通路，糾正Th17/Treg失衡，延緩肺纖維化進展。由此可見，不同濃度的“自身清”可以選擇性調控JAK2/STATs信號通路，雙向調節Th17/Treg分化，溫和抑制SLE-ILD進展。在本實驗中，經托法替布治療后小鼠肺組織中各蛋白均出現明顯降低，IL-17A分泌較模型組減少，說明托法替布可以完全抑制SLE-ILD小鼠肺組織中JAK2/STATs信號通路，控制SLE-ILD發展，提示托法替布作為JAK抑制劑可以非選擇性地抑制JAK2/STATs信號通路，在疾病的急性期可以快速阻斷炎癥進展，然而長期使用會導致機體細胞免疫功能低下，增加感染的風險[24]。可見，兩類藥物對JAK2/STATs信號通路的影響不同，結合本實驗結果可以推測，急性期二者聯合使用可以有效控制疾病進程，緩解期小劑量維持使用 “自身清”對控制疾病復發更具優勢。

綜上所述，“自身清”通過選擇性調控JAK2/STATs信號通路，一方面抑制JAK2/STAT3活化，抑制Th17分化及IL-17A分泌，減輕肺部炎癥及纖維化；另一方面小劑量使用“自身清”，可以活化STAT5/Foxp3相關信號通路，促進Treg細胞分化，糾正Th17/Treg失衡，恢復免疫穩態，且由此導致TGF-β1分泌適量增加，不影響SLE-ILD病情緩解。本研究只是初步探討“自身清”對SLE-ILD的治療作用及JAK2/STATs信號通路的調控作用，關于JAK/STATs信號通路完整的調控機制，如對JAK1、JAK3等作用尚須進一步研究。