兒童原發(fā)免疫性血小板減少癥miR-106b-5p的表達(dá)及其與T細(xì)胞的相關(guān)性研究

王文芳 王緒松 譚三陽 鐘蘭蘭 陳江

（海口市婦幼保健院 1.檢驗(yàn)科；2.兒科，海南海口 570100）

原發(fā)免疫性血小板減少癥（primary immune thrombocytopenia，ITP）是一種兒童常見的自身免疫介導(dǎo)的出血性疾病，可引起皮膚、黏膜、內(nèi)臟出血，存在危及生命的風(fēng)險［1］。盡管ITP為自限性疾病，但仍有一些患兒治療效果不理想，容易發(fā)展為難治性或慢性ITP，因此，對參與ITP 發(fā)病的相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行探討顯得尤為重要。越來越多的研究認(rèn)為，T細(xì)胞免疫因子的比例失衡、免疫抗體的產(chǎn)生及機(jī)體免疫系統(tǒng)的紊亂在ITP發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用［2-3］。輔助性 T 細(xì)胞 17 （T helper cells 17，Th17）是Th 細(xì)胞的一個獨(dú)特而重要的亞群，參與多項免疫應(yīng)答，Th17的功能失調(diào)在ITP發(fā)病中起主要作用［4］。調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（T regulatory cell，Treg）是一種抑制性T細(xì)胞亞群，具有抑制T細(xì)胞的活化及分泌抑制性細(xì)胞因子的功能，可保持免疫系統(tǒng)對自身成分的耐受，在調(diào)節(jié)多種疾病的免疫反應(yīng)中起到很大作用［5］。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）被定義為通過靶向轉(zhuǎn)錄因子和其他在細(xì)胞中作用的元件來控制基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子，在免疫細(xì)胞的發(fā)育、分化及凋亡中發(fā)揮作用，最終影響機(jī)體免疫系統(tǒng)的平衡狀態(tài)［6］。有研究指出，miRNA 的異常表達(dá)與ITP 的發(fā)生發(fā)展、預(yù)后判斷及臨床療效密切相關(guān)［7］。亦有研究認(rèn)為，miRNA 通過調(diào)節(jié)Th17 及Treg 這些細(xì)胞的表達(dá)，導(dǎo)致Th17/Treg 比例失衡，在ITP 的發(fā)病機(jī)制中起至關(guān)重要的作用［8］。近期研究發(fā)現(xiàn)，miR-106b-5p 可調(diào)控機(jī)體多種免疫細(xì)胞的表達(dá)，在細(xì)胞免疫應(yīng)答中起到關(guān)鍵性作用，并參與自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展［9］。然而，關(guān)于 miR-106b-5p 在兒童 ITP 中的表達(dá)情況及其與T 細(xì)胞比例失衡的關(guān)系尚未清楚。因此，本研究通過檢測兒童ITP治療前、治療后miR-106b-5p 的表達(dá)水平，分析其與Th17、Treg、Th17/Treg 的關(guān)系，初步探討 miR-106b-5p 在兒童ITP發(fā)病及治療中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取 2019 年 1 月至 2021 年 7 月在我院就診的ITP 患兒 79 例作為 ITP 組，男 43 例，女 36 例，確診年齡1～14歲，平均年齡（4.1±1.2）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合兒童ITP診斷標(biāo)準(zhǔn)：具有皮膚黏膜出血點(diǎn)、淤斑和/或臟器出血等臨床表現(xiàn)，血小板計數(shù)＜100×109/L，脾臟不大等特征［10］；（2）均行骨髓細(xì)胞學(xué)檢查，符合ITP骨髓象：骨髓巨核細(xì)胞增多或正常，伴有成熟障礙［10］。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）排除其他繼發(fā)性血小板減少癥，合并惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病及自身免疫疾病；（2）不能配合本研究者。另招募自愿參與本研究的健康兒童40 例作為對照組，男24例，女16例，年齡2～14歲，平均年齡（4.2±1.4）歲。本研究通過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，經(jīng)研究對象監(jiān)護(hù)人知情同意。

1.2 治療方法

ITP 患兒均采用靜脈注射用人免疫球蛋白治療，每天400 mg/kg，使用3～5 d；每天分3 次口服潑尼松1.5～2 mg/kg（最大不超過60 mg/d），至血小板計數(shù)＞100×109/L 后穩(wěn)定 1～2 周，最后進(jìn)行藥物減停。另給予抗感染、止血等對癥支持治療。

1.3 主要儀器與試劑

ABI7500 實(shí)時熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司），F(xiàn)ACS Calibur 型流式細(xì)胞儀（美國Becton Dickinson 公司），TRIzol 試劑購自美國Invitrogen 公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR 試劑盒購自大連TaKaRa公司。鼠抗人CD4-FITC 單克隆抗體（簡稱單抗）、CD25-FITC單抗、Foxp3-APC單抗、APC/PE分別標(biāo)記的同型抗體、CD3-PC 單抗、CD8-FITC 單抗、IL-17A-PE單抗、溶血素、RPMI1640培養(yǎng)液及其他相關(guān)試劑均購自美國Becton Dickinson公司。

1.4 標(biāo)本采集及檢測

1.4.1 標(biāo)本采集 所有ITP患兒于治療前、治療后，以及健康兒童于體檢時，均分別采集靜脈血3 mL 置于肝素鈉抗凝管中，-70℃保存待檢。以3 500 r/min，離心半徑12.5 cm，離心10 min 分離血漿。

1.4.2 miR-106b-5p 檢測 應(yīng)用 TRIzol 法提取外周血中總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA的合成，然后按照實(shí)時熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行各目的基因的實(shí)時熒光定量，引物序列：miR-106b-5p上游：5'-ATGCTATCTCATACGT‐GTCA-3'， 下 游 ： 5'-GATCCATAGTCGATCTG‐GAT-3'。使用熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測，采用2-△Ct法計算miR-106b-5p 水平。PCR 總反應(yīng)體系為20 μL：1 μL 引物及探針 Mix，10 μL TaqMan 通用混合物溶液，1.33 μL cDNA，7.67 μL 雙蒸餾水。擴(kuò)增條件：95℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸60 s，進(jìn)行40個循環(huán)。

1.4.3 Th17 及 Treg 檢測 取 100 μL 肝素鈉抗凝血，用RPMI 1640 培養(yǎng)液稀釋（1∶1 等體積），加入 2 μL 刺激劑，孵育 4～6 h 在 37℃恒溫水育箱中，然后加 20 μL CD8-FITC 單抗和 20 μL CD3-PC 單抗混勻，加2 mL 紅細(xì)胞裂解液混勻，離心5 min（1 500 r/min）棄上清。加250 μL 固定破膜劑，然后孵育、洗滌、離心，棄上清加100 μL wash buffer重懸細(xì)胞，加20 μL IL-17A-PE 單抗混勻，再洗滌1 次 （1 mL wash buffer），離心5 min（1 500 r/min）棄上清，加500 μL PBS 重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測Th17。另取100 μL 肝素鈉抗凝全血，分別加20 μL CD4-FITC 單 抗 、20 μL CD25-FITC 單 抗 及2.5 μL Foxp3-APC單抗混勻，再加2 mL紅細(xì)胞裂解液混勻，離心5 min（1 500 r/min）棄上清，加500 μL PBS重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測Treg。

1.5 療效評價

療效評價參考《中國兒童原發(fā)性免疫性血小板減少癥診斷與治療改編指南（2021 版）》［10］中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，分完全有效（治療后相隔7 d以上測定2次，血小板計數(shù)≥100×109/L，且無出血癥狀）、有效（治療后相隔7 d 以上測定2 次，血小板計數(shù)≥30×109/L，為治療前的2 倍以上，且無出血癥狀）、無效（治療后相隔1 d以上測定2次，血小板計數(shù)＜30×109/L，或?yàn)橹委熐暗? 倍以下，或有出血癥狀）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用兩樣本或配對t檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（P25，P75）］表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，組內(nèi)兩兩比較采用Nemenyi檢驗(yàn)。計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ITP組和對照組基線資料比較

ITP組和對照組的年齡、性別、體重指數(shù)、過敏史、血紅蛋白及白細(xì)胞計數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。ITP組血小板計數(shù)低于對照組（P＜0.001）。見表1。

表1 ITP組和對照組基線資料比較

2.2 ITP 組和對照組 miR-106b-5p、Th17、Treg 及Th17/Treg水平比較

ITP 組 miR-106b-5p、Th17、Th17/Treg 水平高于對照組，Treg水平低于對照組（P＜0.001），見表2和圖1～2。

表2 ITP組和對照組miR-106b-5p、Th17、Treg及Th17/Treg水平比較 （）

表2 ITP組和對照組miR-106b-5p、Th17、Treg及Th17/Treg水平比較 （）

注：［ITP］原發(fā)免疫性血小板減少癥；［Th17］輔助性T 細(xì)胞17；［Treg］調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。

Th17/Treg 0.08±0.04 0.76±0.15 16.712＜0.001組別對照組ITP組例數(shù)40 79images/BZ_74_1284_2983_1726_3101.pngmiR-106b-5p 0.83±0.15 2.37±0.94images/BZ_74_1726_2983_1910_3101.pngTh17(%)0.60±0.24 2.18±0.62images/BZ_74_1910_2983_2061_3101.pngTreg(%)8.5±1.8 2.9±1.0

圖1 ITP組和對照組Th17流式細(xì)胞檢測圖

圖2 ITP組和對照組Treg流式細(xì)胞檢測圖

2.3 ITP 患兒治療前后 miR-106b-5p、Th17、Treg及Th17/Treg水平比較

ITP患兒治療后miR-106b-5p、Th17、Th17/Treg水平低于治療前，Treg水平高于治療前（P＜0.001），見表3。

表3 79例ITP患兒治療前后miR-106b-5p、Th17、Treg及Th17/Treg水平比較 （）

表3 79例ITP患兒治療前后miR-106b-5p、Th17、Treg及Th17/Treg水平比較 （）

注：［Th17］輔助性T細(xì)胞17；［Treg］調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。

組別治療前治療后Th17/Treg 0.76±0.15 0.19±0.07 13.150＜0.001images/BZ_75_238_2274_629_2392.pngmiR-106b-5p 2.4±0.9 1.5±0.5images/BZ_75_629_2274_806_2392.pngTh17(%)2.2±0.6 1.1±0.4images/BZ_75_806_2274_987_2392.pngTreg(%)2.9±1.0 5.3±1.5

2.4 不同療效ITP 患兒miR-106b-5p、Th17、Treg及Th17/Treg水平比較

完全有效組 miR-106b-5p、Th17、Th17/Treg 水平低于有效組和無效組，Treg水平高于有效組和無效 組 （P＜0.05）。 有 效 組 miR-106b-5p、 Th17、Th17/Treg 水平低于無效組，Treg 水平高于無效組（P＜0.05）。見表4。

表4 不同療效ITP患兒miR-106b-5p、Th17、Treg及Th17/Treg水平比較 ［M（P25，P75）］

2.5 血漿 miR-106b-5p 表達(dá)水平與 Th17、Treg 及Th17/Treg的相關(guān)性

Pearson 相關(guān)分析顯示，ITP 患兒血漿miR-106b-5p 表達(dá)水平與Th17、Th17/Treg 均呈正相關(guān)（分別r=0.730、0.816，均P＜0.001），與Treg 呈負(fù)相關(guān) （r=-0.774，P＜0.001）。對照組血漿 miR-106b-5p表達(dá)水平與Th17、Treg及Th17/Treg均無相關(guān)性（P＞0.05）。見表5。

表5 血漿miR-106b-5p表達(dá)水平與Th17、Treg及Th17/Treg的相關(guān)性

3 討論

兒童ITP是一種自身免疫性疾病，其特征是由于血小板清除增強(qiáng)和生成受損而導(dǎo)致血小板計數(shù)降低，其發(fā)生發(fā)展與機(jī)體免疫系統(tǒng)功能異常及巨核細(xì)胞異常有關(guān)［11］。Th17 和 Treg 細(xì)胞均為 CD4+T細(xì)胞亞型中的重要細(xì)胞。Li 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，ITP 患者外周血中miR-106b-5p 表達(dá)升高，miR-106b-5p通過誘導(dǎo)了Th17/Treg的免疫失衡，在ITP 的發(fā)展中起重要作用。但miR-106b-5p在兒童ITP中的表達(dá)情況尚未清楚。

本研究中 ITP 組 miR-106b-5p、Th17 及 Th17/Treg水平明顯高于對照組，而ITP組Treg水平明顯低于對照組，提示miR-106b-5p 在ITP 患兒中異常高表達(dá)，其可能通過調(diào)控Th17、Treg 及Th17/Treg來參與ITP 的發(fā)病過程。相關(guān)分析也顯示，miR-106b-5p 表達(dá)水平與Th17、Th17/Treg 均呈正相關(guān)，與Treg呈負(fù)相關(guān)。提示miR-106b-5p的異常表達(dá)與Th17、Treg 及Th17/Treg 水平有重要聯(lián)系，可能是導(dǎo)致ITP患兒Th17/Treg比例失衡的關(guān)鍵因素。Qian等［13］研究發(fā)現(xiàn)，ITP患者miR-106b-5p表達(dá)水平升高，參與ITP 發(fā)病和疾病進(jìn)展過程，可能是ITP 有價值的潛在生物標(biāo)志物。He等［14］研究證實(shí)，Th17與Treg 之間有重要聯(lián)系，Th17/Treg 的不平衡可破壞機(jī)體免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能失調(diào)，最終造成ITP發(fā)生。亦有研究認(rèn)為，miRNA的異常表達(dá)可導(dǎo)致ITP 患者Th17/Treg 失衡，增加機(jī)體免疫反應(yīng)和炎癥損傷，進(jìn)而參與ITP的發(fā)生發(fā)展，是一個新的治療ITP的潛在靶點(diǎn)［15］。

本研究采用糖皮質(zhì)激素與丙種球蛋白沖擊治療ITP，結(jié)果顯示ITP 患兒治療后miR-106b-5p、Th17、Th17/Treg 水平明顯低于治療前，Treg 水平明顯高于治療前；完全有效組miR-106b-5p、Th17、Th17/Treg 水平明顯低于有效組和無效組，Treg水平明顯高于有效組和無效組。說明在ITP患兒治療過程中檢測miR-106b-5p、Th17、Treg 及Th17/Treg水平，對ITP患兒的療效判斷具有較好的指導(dǎo)作用。由此推測丙種球蛋白沖擊治療可能通過抑制miR-106b-5p的表達(dá)，恢復(fù)Treg功能，糾正Th17/Treg 比例失衡，進(jìn)而達(dá)到治療ITP 的目的。Cheng 等［16］研究指出，ITP 患者 Th17 細(xì)胞及細(xì)胞因子增多，而Treg 細(xì)胞及細(xì)胞因子受到抑制，Th17/Treg比例失衡在ITP的發(fā)病中起重要作用，經(jīng)免疫抑制治療后Treg 細(xì)胞活性顯著提高，Th17/Treg紊亂被糾正。另有研究表明，與健康對照組相比，ITP 患者的Treg 細(xì)胞及miRNA 的表達(dá)存在差異，miRNA通過調(diào)控Treg細(xì)胞參與ITP的免疫發(fā)病機(jī)制，miRNA 的功能喪失促進(jìn)了免疫紊亂，可能為ITP的免疫靶向治療帶來新的思路［17］。

本研究的局限性在于單中心的臨床研究、樣本量較少、隨訪時間短，無法全面評估m(xù)iR-106b-5p在ITP中的長期變化，今后仍有待進(jìn)一步深入研究，并加以完善。

綜上所述，ITP 患兒中血漿miR-106b-5p 異常高表達(dá)，其高表達(dá)與Th17/Treg 比例失衡有關(guān)，在ITP患兒治療過程中檢測miR-106b-5p、Th17、Treg及Th17/Treg 水平，對ITP 患兒的療效判斷具有較好的指導(dǎo)作用，提示miR-106b-5p 可能是兒童ITP的重要標(biāo)志物及臨床治療的潛在靶點(diǎn)。