不同腸內營養開始時間對極低出生體重兒腸道菌群及代謝產物影響的前瞻性研究

申玉潔 李祿全 魏璐 張先紅 趙文靜 劉曉晨 吳利平

（重慶醫科大學附屬兒童醫院新生兒科/國家兒童健康與疾病國家臨床研究中心/兒童發育疾病研究教育部重點實驗室/兒科學重慶市重點實驗室，重慶 400014）

腸道是人類微生物種群最多、最復雜的部位，在成人腸道內有400 多種細菌，總數達1×1014個。腸道菌群對宿主整個生命周期的健康發揮重要作用，通過對腸道菌群動態變化的檢測，可以反映出宿主發育的軌跡。研究表明，腸道菌群與新生兒發育和免疫系統的形成密切相關，生命早期腸道菌群的結構、相對豐富度及其代謝產物短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）影響兒童日后患疾病的概率［1］。因此，監測腸道菌群在生命早期的變化具有重要的臨床意義。而新生兒生后腸道菌群定植受多種因素影響，如出生方式、喂養方式、胎齡和抗生素應用等，尤其是喂養方式，其中腸內營養開始時間的早晚直接影響了新生兒期腸道菌群的建立［2］。極低出生體重兒（very low birth weight infant，VLBWI）由于消化系統未成熟，常需靜脈營養支持以滿足基本營養需要，但也容易發生院內感染和由深靜脈置管引起的并發癥［3］。故指南推薦VLBWI 營養策略是在保證安全的前提下，盡早建立腸內營養，盡快達到足量全腸內喂養［4］。然而，目前VLBWI 腸內營養開始時間存在爭議，且開始時間“早”或“晚”的定義尚不統一，過早易導致喂養不耐受、壞死性小腸結腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）的發生，而延遲喂養又可能影響胃腸道的發育［5-6］。故本研究通過前瞻性地觀察VLBWI 腸內營養開始時間，探討不同腸內營養開始時間對腸道菌群及其代謝產物的影響，為尋找適宜的VLBWI 腸內營養開始時間提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

前瞻性選取重慶醫科大學附屬兒童醫院新生兒科2020年6～12月收治的VLBWI為研究對象。納入標準：（1）胎齡＜30周；（2）出生體重＜1 500 g；（3）日齡＜24 h；（4）純母乳喂養。排除標準：（1）住院期間死亡或放棄治療者；（2）入院診斷為NEC（Bell 分期Ⅱ期及以上）、食物蛋白過敏性腸炎、乳糖不耐受等能夠影響腸道菌群的消化道疾病者；（3）合并先天性消化道畸形者；（4）未完成糞便菌群及SCFAs 測定者；（5）不愿參加本研究者。共納入29 例患兒，根據生后腸內營養開始時間（開奶時間）不同分為＜24 h 組（n=15）和24～72 h組（n=14）。

本研究通過由我院倫理委員會批準（No.2021-67），并簽署了家屬知情同意書。

1.2 腸內及腸外營養方案

參照 2015 年加拿大 VLBWI 喂養指南［4］，生后24 h內開始靜脈營養支持，并根據患兒病情和喂養是否耐受擇期進行腸內營養。（1）腸內營養：采用母乳喂養、經管飼喂養；間歇喂養每3 h 1次；開始喂養量10～20 mL/(kg·d)，緩慢增加，增加速度15～20 mL/(kg·d)，直至達到全腸內營養 150 mL/(kg·d)。病情穩定、無喂養禁忌證者，生后24 h 內開始喂養，通過胃內回抽殘余奶量的方式判斷消化吸收情況，若3 h后胃殘余量超過前1次喂養量的50%，并伴有嘔吐和/或腹脹，則視為喂養不耐受，予暫禁食，次日9點再試喂1次；反之為喂養耐受，當天即開始腸內營養［7］。（2）靜脈營養：第1天給予氨 基 酸 ， 起 始 劑 量 為 1.0～1.5 g/(kg·d)， 按 0.5～1 g/(kg·d)增加，直至總量達到3.5～4.0 g/(kg·d)；第2 天開始給予脂肪乳劑，起始劑量為1.0 g/(kg·d)，按0.5～1 g/(kg·d)增加，直至總量達到3 g/(kg·d)。

1.3 糞便標本收集及保存

所有納入本研究的患兒均于生后第2 周、第4周用無菌糞便收集器采集新鮮糞便標本后，每管稱量250 mg糞便標本分裝至1.5 mL 消毒去酶EP管中，凍存于-80℃冰箱備用。

1.4 糞便標本DNA提取、PCR擴增和高通量測序

用 QIAamp FAST DNA Stool Mini-Kit （德國Qiagen）提取糞便菌群基因組DNA。在1%的瓊脂糖凝膠上檢測DNA 提取物，并用分光光度計（NanoDrop 2000 UV-vis，Thermo Scientific，美國）評估DNA 的濃度和純度。用引物338F （5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'） ， 806R （5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'） 擴增腸道細菌16S rDNA 基因的V3～V4 高變區。擴增步驟如下：初始變性（95℃、3 min），變性（95°C持續30 s），退火 （55°C 持續30 s） 和延伸 （72°C 持續45 s），共27個循環，再進行延伸（72°C持續10 min）。凝膠電泳分離產物，使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒 （Axygen BioSciences） 回 收 ， 并 用 Quantus Fluorometer（Promega，USA）定量。創建數據庫，并在與Illumina MiSeq相關的平臺上對其進行排序。

1.5 糞便標本生物信息分析

使用UPARSE 7.1 版將處理后的序列分為可操作的生物分類單位（operational taxonomic units，OTU），以97%的相似性閾值與OTU進行生物信息學聚類分析，對數據進行Alpha多樣性分析（腸道菌落中物種的豐富度、多樣性分別用Chao 指數值和Shannon指數值來體現）和群落組成分析。

1.6 糞便標本SCFAs測定

乙酸乙酯依次加入8種SCFAs標品和2-乙基丁酸制得8 種SCFAs 的混標儲備溶液和內標儲備液。兩者混合后用乙酸乙酯稀釋成8個不同濃度的工作液 。 適 量 樣 本 研 磨 （3 min、 2 次 ）、 冰 浴（30 min）、靜置 （4℃、30 min）、離心 （4℃、15 min），萃取后冰浴 （10 min），13 000 g 離心（4℃、10 min）后進行氣相色譜-質譜檢測分析。采用Masshunter定量軟件對目標SCFAs進行自動識別和積分，并輔助人工檢查。通過標準曲線計算并換算出樣品中SCFAs的實際含量。

1.7 統計學分析

采用SPSS 23.0 軟件進行統計學分析。正態分布的計量資料用均數±標準差（）表示，組間比較采用兩樣本t檢驗，組內比較采用配對t檢驗。非正態分布的計量資料用中位數（四分位數間距）［M（P25，P75）］ 表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，組內比較采用Wilcoxon符號秩和檢驗。計數資料采用例數和百分率（%）表示，組間比較采用Fisher確切概率法。P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患兒一般資料

共收治60 例VLBWI，其中住院期間死亡和放棄者7例，先天性消化道畸形9例，未完成腸道菌群和SCFAs 測定者5 例，不愿意參與本研究者10例，最終納入29例VLBWI。生后開奶時間＜24 h組15 例，24～72 h 組 14 例，所有患兒均在 3 d 內成功開奶。2 組VLBWI 性別、出生情況、母孕期情況、呼吸機使用時間和藥物使用情況、住院時間及并發癥等指標比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 2組不同腸內營養開始時間VLBWI臨床指標對比

表1（續）

2.2 腸道菌群Alpha多樣性分析

開奶時間＜24 h 組生后第4 周Chao 指數較第2周下降（P＜0.05），Shannon指數差異無統計學意義（P＞0.05）。24～72 h 組生后第 2 周和第 4 周 Chao 指數和Shannon 指數差異均無統計學意義（P＞0.05）。開奶時間＜24 h組與24～72 h組比較，生后第2周和第4周Chao指數和Shannon指數差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同腸內營養開始時間VLBWI糞便的菌群Alpha多樣性分析

2.3 腸道菌群豐富度比較

在門水平上，開奶時間＜24 h 組生后第4 周變形菌門減少，厚壁菌門增加（P＜0.05）；在屬水平上，不動桿菌屬減少，韋榮球菌屬、梭菌屬增加（P＜0.05）。24～72 h 組生后第 4 周腸道菌群在門、屬水平上變化差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 腸道菌群豐富度組內比較

開奶時間＜24 h 組與24～72 h 組比較，生后第2周和第4周主要菌群在門、屬水平上差異均無統計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 腸道菌群豐富度組間比較

2.4 SCFAs測定

開奶時間＜24 h組和24～72 h組第4周SCFAs 總量較第2 周均升高（P＜0.05）。第4 周，開奶時間＜24 h 組乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、異己酸均升高（P＜0.05），24～72 h組丙酸、丁酸、戊酸升高（P＜0.05）。生后第4 周開奶時間＜24 h 組丙酸高于 24～72 h 組 （P＜0.05），SCFAs 總量及其他各SCFAs含量差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 不同腸內營養開始時間VLBWI糞便的SCFAs含量分析 ［M（P25，P75），μg/g］

3 討論

腸道菌群的組成與NEC、喂養不耐受等新生兒腸道疾病的發生存在明顯相關性，而開奶時間的早晚直接影響了VLBWI 早期腸道菌群的建立。本研究發現不同開奶時間對腸道代謝產物SCFAs水平產生較大影響，而對腸道菌群的多樣性、豐富度的影響則不明顯。

VLBWI 由于離開母體時胎齡不足，胃腸道運動發育不成熟，導致VLBWI 不能早期開始腸內營養或出現喂養不耐受。動物實驗顯示，小鼠完全腸外營養禁食3 d后，會出現腸絨毛變平、腸黏膜萎縮等癥狀，提示僅進行腸外營養支持對消化功能發育有一定影響［8］。國外研究已證實，VLBWI開奶時間越晚，其喂養不耐受發生率越高，而早期經口喂養可使VLBWI 腸道較早得到食物有效刺激，從而使其腸道蠕動活動增多，增加機體內腸道激素分泌，有利于胃腸動力學改變，促使腸道黏膜的上皮細胞發育和成熟，故早期喂養策略對VLBWI 而言不僅是營養支持更是治療手段［9］。本研究中，VLBWI 生后24 h 內開始腸內營養的15 例（占52%），其余14 例均在72 h 內成功實現腸內喂養，總體開奶時間早于于新穎等［10］的研究，其原因可能是喂養乳品不同。本研究采用母乳開奶，相比早產兒配方奶，母乳不僅可為VLBWI 提供豐富的營養物質，保證其生長發育，且其中所含的高比例的乳清蛋白和低含量的脂肪、乳糖量，更有利于VLBWI吸收和加速胃排空。

新生兒腸道菌群的定植最早可追溯至宮內時期。研究發現，在宮內時新生兒少量的菌群定植可能來源于母體子宮內胎盤和羊水［11］；在分娩時，分娩方式的不同（如順產/剖宮產）則明顯影響不同微生物菌群在新生兒的定植，有研究報道，與剖宮產新生兒相比，順產新生兒經過產道時更有機會接觸更多的共生菌群，從而有益于優勢菌群的定植［12］；在出生后，不同的生活環境及抗生素的使用則明顯改變新生兒微生物菌群的豐富度和多樣性［13］。本研究中，與開奶時間＜24 h 組相比，24～72 h 組 VLBWI 在生后第 2 周、第 4 周時間點的腸道菌群豐富度和多樣性指標均無差異，這可能有幾方面的原因。第一，開奶時間＜24 h 組和24～72 h 組的順產比例不同（53% vs 29%）。雖然2 組數據差異無統計學意義，但后者順產比例相對較低，可能會影響2組間腸道菌群的組成。第二，采集時間點單一。由于影響腸道菌群組成的因素眾多，僅在單一的時間點（生后第2周、第4周）采集樣本可能會使結果產生偏倚。第三，樣本量局限。由于不同個體的腸道菌群分布差異較大，尤其在人群樣本中更為明顯，故在小樣本調查研究時，可能導致出現2組間差異無統計學意義。

SCFAs大多是未經吸收利用的膳食纖維被大腸的腸道菌群發酵而生成的，其中丁酸、乙酸、丙酸是主要SCFAs，占腸腔內產生SCFAs 85%以上［14］。在本研究中，與24～72 h組相比，開奶時間＜24 h 組VLBWI 在生后第4 周時的丙酸水平明顯偏高，其他SCFAs 水平則無明顯改變。許多研究已經報道，不同SCFAs 在維持腸道穩態、糖脂代謝調節、神經認知調節、免疫調節等方面扮演重要的作用［14-16］，而其中大多數研究關注丁酸鹽，再較少延伸至乙酸鹽，丙酸在生理和病理方面的潛在作用一直被低估，相關文獻較少。現有證據表明，丙酸在維持腸道穩態、免疫調節等方面起重要的作用，如丙酸可增加腸道緊密連接蛋白如ZO-1、occludin 的含量以增強了腸道上皮屏障，減少了腸道炎癥及氧化應激［17-18］，且丙酸可通過腸-腦軸對抗中樞和腸道神經系統的炎癥激活［19］；此外，丙酸還具有調節適應性免疫的重要生理功能，抑制組蛋白去乙?；傅幕钚?，增加調節T細胞的產生，調節T 細胞對減少腸道炎癥至關重要［20］，且減少了腸道γδT 細胞產生白細胞介素-17 和白細胞介素-22［21］，促進結腸內環境的穩定。在動物實驗中，補充丙酸可激活Nrf2 介導的抗炎和抗氧化途徑，保護新生小鼠肺微血管內皮細胞免受由脂多糖引起的肺泡簡單化和異常血管生成，以預防支氣管肺發育不良［22］。而本研究中2 組患兒均存活出院，且住院時間及腹瀉、腹脹、便秘等相關指標差異無統計學意義，考慮樣本量小，觀察時間較短，仍需后期隨訪等。

本研究有一定的局限性。本研究涉及的取樣時間點及樣本量較少，而新生兒出生后由于環境的突然改變導致的生理指標變化較大，使得本研究的結論有一定的片面性；另外，由于只檢測腸道SCFAs 的含量而不是直接檢測血液及組織中SCFAs的含量，導致SCFAs解釋糖脂類調節、免疫調節等疾病的相關性較低。然而，該指標用于評價由腸道菌群失調、腸道SCFAs 紊亂導致的腸道疾病時則有一定的參考價值。

因此，與腸道營養開始時間較晚相比，在24 h內開始腸道營養可增加VLBWI 第4 周時腸道丙酸水平，而對其他SCFAs 水平及腸道微生物分布則可能沒有明顯影響，這為解釋早期腸內營養患兒的預后總體較好提供可能的依據。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。