基于二代測序技術對非小細胞肺癌八基因聯合檢測的突變分析

譚茜，袁正泉，謝麗云，龔燕飛

(岳陽市中心醫(yī)院，湖南 岳陽 414000)

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率在所有癌癥中均排首位[1]。非小細胞肺癌(NSCLC)是我國肺癌的主要病理類型，占肺癌患者總數的80%～85%。大多數肺癌患者在早期無明顯癥狀，初診時已經處于晚期。據統計，Ⅲ期肺癌患者的5 年生存率僅為20%[2]。由此可見，晚期肺癌患者的生存率非常低。近年來由于肺癌驅動基因的研究，對肺癌患者的治療已進入精準治療的時代。

通過基因檢測技術，找到肺癌患者相應驅動基因，針對性應用靶向治療藥物，使肺癌患者中位生存期明顯延長，療效得到顯著改善，部分患者甚至可以達到無進展緩解[3]。二代測序技術(NGS)能夠大規(guī)模平行檢測NSCLC多個驅動基因，其檢測通量高、速度快、準確度高，在探索新的生物標志物并靶向識別特異性基因突變方面具有獨特的優(yōu)勢，從而有助于臨床制訂個性化的肺癌靶向治療方案[4]。本研究收集148 例NSCLC患者樣本，在illumina MiseqDX平臺上平行檢測肺癌表皮生長因子受體(EGFR)、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS)、間變性淋巴瘤激酶(ALK)、鼠類肉瘤濾過性毒菌(v-raf)致癌同源體B1(BRAF)、酪氨酸激酶受體2(ERBB2)、間質-上皮細胞轉化因子(MET)、ROS肉瘤致癌因子1(ROS1)和轉染重排原癌基因(RET)8 個驅動基因的突變情況，分析其與臨床病理特征間的關系，探討NGS檢測技術對于治療肺癌的臨床應用價值，為肺癌的個體化治療提供有力的證據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2020年7月—2021年7月148 例NSCLC患者的組織樣本，其中手術蠟塊18 例，穿刺蠟塊104 例，胸腔積液細胞蠟塊7 例，新鮮組織19 例。依據2015版WHO肺癌病理分類標準，肺腺癌134 例，鱗癌13 例，肉瘤樣癌1 例；原發(fā)灶124 例，轉移灶17 例，胸腔積液蠟塊7 例。148 例NSCLC患者中，男87 例，女61 例；年齡<60 歲者62 例，年齡≥60 歲者86 例；有吸煙史74 例，無吸煙史74 例；臨床分期方面，Ⅰ期+Ⅱ期41 例，Ⅲ期+Ⅳ期94 例，分期不明確13 例；原發(fā)灶左肺54 例，右肺70 例，資料不明確者24 例。本研究經院醫(yī)學倫理委員會批準，且患者均知情同意。

1.2 試劑與儀器

本研究采用廣州燃石基因有限公司的核酸提取試劑盒進行DNA提取，通過人多基因突變檢測試劑盒(朗克)進行文庫構建，測序分析所用實驗儀器為美國illumina MiseqDX高通量測序儀。

1.3 DNA提取和驅動基因測序

所有樣本采用核酸提取純化試劑盒提取DNA，Qubit定量方法進行濃度測定，電泳法評估DNA樣本的質量。腫瘤細胞含量≥10%，DNA樣本總量≥30 ng，質量為C或C級以上為合格，合格樣本采用人多基因突變聯合檢測試劑盒(朗克)進行建庫，最后在illumina MiseqDX測序儀上進行測序分析。

1.4 統計學方法

采用SPSS20.0系統軟件進行統計學分析。變量組間比較采用χ2檢驗，理論頻數<5的則采用Fisher確切概率法，所有P值均基于雙向假設檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 8個驅動基因突變狀態(tài)

本研究的148 例患者中突變116 例(78.4%)，其中EGFR突變、KRAS突變以及ALK融合的發(fā)生率較高，分別為53.4%(79/148)，10.1%(15/148)，7.4%(11/148)；其他基因BRAF，ERBB2，MET，ROS1和RET突變率較低，分別為2.0%(3/148)，2.0%(3/148)，1.4%(2/148)，1.4%(2/148)和0.7%(1/148)。其中EGFR突變率在女性、不吸煙以及肺腺癌患者中的發(fā)生率明顯高于男性(P<0.001)、吸煙(P<0.001)以及肺鱗癌(P=0.008)患者，差異有統計學意義；而KRAS突變則在男性、吸煙患者中的發(fā)生率顯著高于女性、不吸煙的肺癌患者，差異有統計學意義(P<0.01)。ALK，BRAF，ERBB2，MET，ROS1和RET這6 個基因的突變率均未發(fā)現與患者性別、年齡、吸煙史、組織分型以及臨床分期等存在相關性(見表1)。

2.2 EGFR基因各位點突變情況

本研究中EGFR基因突變79 例(53.4%)，突變頻率最高，其中包含65 例單點突變，14 例雙點突變。單點突變類型中，以19Del的突變例數最多(39 例)，其次為L858R突變(22 例)。另外雙點突變中有6 例伴隨T790M耐藥突變(見表2)，這類患者服用EGFR-TKI靶向藥物后的療效以及預后有限。

2.3 雙位點共變異情況

在檢出突變的116 例樣本中，存在雙位點共變異現象21 例(見表2)。其中，雙基因共變異3 例，包括ERBB2/KRAS基因突變1 例，EGFR 19Del/KRAS基因突變1 例，EGFR 19Del/ROS1-SDC4融合1 例。EGFR 19Del/ROS1-SDC4融合仍然可以采用相應的靶向藥物進行治療，而KRAS/EGFR和KRAS/ERBB2共突變患者對EGFR-TKIs藥物不敏感。

2.4 不同樣本類型驅動基因突變檢出率

原發(fā)灶的突變檢出率為79.0%(98/124)，轉移灶的突變檢出率為82.4%(14/17)，差異無統計學意義(P=1.000)。在不同樣本類型中，新鮮組織、穿刺蠟塊、手術蠟塊、細胞蠟塊的突變檢出率依次是89.5%，74.0%，100.0%及57.1%，差異有統計學意義(P<0.05)(見表3)。

表1 148 例非小細胞肺癌患者的8 個驅動基因突變者的臨床特征單位：例(%)

3 討 論

迄今為止，肺癌仍然是中國甚至世界范圍內癌癥死亡的主要原因，并且病死率逐年上升。臨床上，超過60%的肺癌晚期患者無法進行手術治療，預后較差[5]，嚴重影響晚期肺癌患者的生存率。隨著針對特定驅動基因改變的靶向治療的出現，肺癌的精準治療獲得了新的發(fā)展。二代測序技術能夠通過檢測驅動基因，予以肺癌患者針對性的治療干預，如表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)(克唑替尼、奧希替尼)等，從而延緩疾病進展、延長生存時間、改善生活質量[6]。基于二代測序技術聯合檢測NSCLC中8 個驅動基因的變異情況，大大縮短了檢測時間，節(jié)省了腫瘤組織標本，能夠對多種基因突變同時進行高精度和高靈敏度的篩選，例如單/多核苷酸的突變、小基因與大基因的插入和缺失、拷貝數擴增和基因融合等[7]。本研究148 例NSCLC患者中，各驅動基因檢測EGFR突變陽性率為53.4%，KRAS陽性率為10.1%，ALK為7.4%，RBB2，BRAF，MET，ROS1和RET陽性率較低，分別為2.0%，2.0%，1.4%，1.4%和0.7%，符合既往報道[8]。在EGFR突變的NSCLC中，突變類型多樣，其中最常見的突變類型是19號外顯子缺失和21號外顯子L858R突變，與既往研究報道一致[9]。在EGFR突變群體中，EGFR在不吸煙的女性患者中突變率較高，差異具有統計學意義(P<0.001)，與既往研究結果相近[10]。研究表明[11]，EGFR突變與EGFR-TKI(如吉非替尼、厄洛替尼等)的臨床療效有一定的相關性，尤其對于晚期NSCLC患者的治療，療效令人矚目。雖然EGFR-TKI對攜帶20號外顯子突變的NSCLC患者敏感性低于常見的19號和21號外顯子突變，存在異質性，但是相對于傳統的化療，靶向治療仍然具有比較大的優(yōu)勢。在本次研究中，有6 例EGFR 19Del和L858R突變的患者同時出現T790M的耐藥性突變，因此，這類患者在使用一代或二代EGFR-TKI的治療過程中，臨床效果不顯著，其無進展生存期(PFS)明顯低于只有19Del和L858R的患者[12]。本研究顯示，與KRAS野生型相比，KRAS突變主要發(fā)生在肺腺癌、有吸煙史的男性患者中，差異具有統計學意義(P<0.05)，符合既往研究報道[8]。KRAS基因突變可導致對TKI原發(fā)耐藥，是晚期NSCLC患者預后的不利因素，因此攜帶KRAS突變的NSCLC患者是免疫治療相對獲益人群[13]。ALK融合是NSCLC中繼EGFR突變之后第二個明確可用藥的腫瘤驅動基因，多見于男性肺腺癌患者，并且在不吸煙的年輕患者中發(fā)生率較高，但差異不具有統計學意義。ALK-EML4融合基因是肺腺癌患者ALK融合的主要類型，攜帶ALK融合的NSCLC對多種酪氨酸激酶抑制劑敏感，可推薦使用克唑替尼或第二代ALK抑制劑塞瑞替尼等靶向藥[14]。

表2 NSCLC患者8 個基因檢測雙位點共變異類型及比例

表3 不同樣本類型突變基因突變檢出率單位：例(%)

在本研究中，有3 例NSCLC患者存在2個基因突變共存現象，分別是EGFR 19Del/KRAS，KRAS/ERBB2共突變以及EGFR 19Del/ROS1融合共存。既往研究報道[15]EGFR突變合并ALK融合的患者TKI療效與單基因突變患者相比更差，但仍優(yōu)于化療，因此，聯合使用EGFR抑制劑和ALK融合抑制劑可能是一種有效的治療方法。由此猜想，與EGFR單基因突變患者相比，EGFR突變合并ROS1融合的患者使用TKI的療效較差。而EGFR或ERBB2合并KRAS突變時，使用EGFR抑制劑療效不佳。另外，聯合突變是否比單一突變患者的預后更差尚不清楚。因此，多基因共存突變的發(fā)生機制以及在腫瘤中作用機制的研究仍具有很大的挑戰(zhàn)性。同時，我們對原發(fā)灶和轉移灶以及不同樣本類型之間驅動基因突變檢出率進行了統計(見表3)，發(fā)現原發(fā)灶和轉移灶中的突變檢出率差異無統計學意義，因此原發(fā)灶和轉移灶的組織標本均可用于肺癌驅動基因突變的檢測[16]。但是，在不同取材方法之間驅動基因的檢出率卻存在差異(P<0.05)(見表3)。穿刺蠟塊檢出率偏低可能與樣本質量、腫瘤細胞含量及腫瘤異質性等相關?？偠灾?，NGS基因檢測技術在肺癌基因檢測中具有獨特的優(yōu)勢，可對多個樣本類型的DNA進行準確的腫瘤驅動基因突變檢測，指導晚期NSCLC的治療，但是在質量評估和腫瘤細胞含量這些質控環(huán)節(jié)需嚴格把控，方能提高突變基因檢出率，避免假陰性。

總而言之，NGS基因檢測技術在肺癌基因檢測中有獨特的優(yōu)勢，具有極高的靈敏度與特異性，能夠幫助臨床全面了解腫瘤突變情況，對NSCLC患者實現精準個性化治療，從而使更多的肺癌患者從靶向治療中獲益。