四黃栓制備工藝和質量標準研究*

吳安超，林詠梅，施婭妮，張 靜，陳軍亮

（云南省中醫醫院，云南 昆明 650100）

四黃軟膏由大黃、黃芩、黃連、黃柏、冰片5味中藥材組方，主要用于濕熱下注所致痔瘡、肛裂、肛漏、肛周腫痛或瘙癢、大便帶血，肛管炎見上述證候者。方中，大黃、黃連、黃柏、黃芩清熱解毒，散腫，化瘀止痛；冰片辛香走竄，散熱結，消腫痛，燥濕熱，具有去惡生新功效［1］。原方為云南中醫藥大學第一附屬醫院肛腸科鐘傳珍教授的經驗方，臨床應用療效明顯。但原制備工藝過于簡單，有效成分未經提取純化，載藥量低，穩定性較差，質量難以控制。軟膏劑不易準確定量，使用過程中易造成二次交叉污染，且換藥過程中極易造成傷口疼痛，藥物殘渣滯留于肛門，不利于痔瘡康復［2-3］。為此，本研究中將四黃軟膏的劑型改成栓劑，通過正交試驗優化了處方藥材的醇提工藝，并建立了控制栓劑的質量標準。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BSA224S 型電子分析天平（德國Sartorius 公司，精度為0.1 mg）；R-300HL 型旋轉蒸發儀（瑞士步琦有限公司）；DLSB- /510型低溫冷卻液循環泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；DHG-9140A 型電熱鼓風干燥箱（廣東泰宏君科學儀器股份有限公司）；SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；RBY-A型融變時限試驗儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）；島津LC-20AD型高效液相色譜儀（日本島津公司），配有LCsolution工作站，可變波長掃描紫外檢測器；硅膠H薄層板、硅膠G板、聚酰胺薄膜（青島海洋化工廠）。

1.2 試藥

鹽酸小檗堿對照品（批號為110713-201814，純度為86.8%），大黃對照藥材（批號為120984-201202），黃連對照藥材（批號為121752 - 201801），黃芩對照藥材（批號為120955 - 201810），黃柏對照藥材（批號為121510 - 201807），均購于中國食品藥品檢定研究院；大黃酸對照品（批號為DST20081909，純度為86.8%），黃芩苷對照品（批號為DST200601，純度不低于98%），均購于成都德思特生物技術有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 提取浸膏中鹽酸小檗堿含量測定

2.1.1 色譜條件［1］

色譜柱：Phenomenex C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液（每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，加磷酸調pH至4.0）-乙腈（50∶50，V/V）；流速：0.8 mL/ min；檢測波長：345 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

2.1.2 浸膏粉制備

以75%乙醇為提取溶劑，于75 ℃水浴加熱，回流提取，濾液置旋轉蒸發儀，回收乙醇，蒸至流浸膏狀，轉移至蒸發皿中，置105 ℃恒溫箱中烤干，得浸膏粉。

2.1.3 溶液制備

取鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加甲醇-鹽酸溶液（100∶1，V/V），超聲處理（功率為120 W，頻率為65 kHz）20 min至完全溶解，得質量濃度為0.19 mg/mL的對照品溶液。取浸膏粉，研成細粉，混勻，取0.1 g，精密稱定，加甲醇 - 鹽酸溶液（100∶1，V/V）100 mL，密塞，稱定質量，搖勻，60 ℃水浴加熱15 min 使溶解，超聲處理（功率為120 W，頻率為65 kHz）30 min，放至室溫，擦干錐形瓶外壁的水，稱定質量，用甲醇- 鹽酸溶液（100∶1，V/V）補足減失的質量，搖勻，濾過，取濾液，加甲醇 - 鹽酸溶液（100∶1，V/V）稀釋5倍，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜濾過［1］，即得供試品溶液。

2.1.4 含量測定

分別取2.1.3 項下供試品溶液和對照品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，用外標法計算樣品中鹽酸小檗堿的含量。

2.2 制備工藝研究

2.2.1 提取工藝優化

正交試驗：采用SPSS 19.0 統計學軟件設計正交試驗，以提取時間（因素A）、加溶劑量（因素B）、提取次數（因素C）為考察因素，每個因素設計3 個水平，因素與水平設計見表1。按處方量稱取大黃、黃連、黃柏和黃芩4味藥材9份，正交試驗測定出膏率和浸膏中鹽酸小檗堿的含量，以二者為綜合指標優選最佳提取工藝。出膏率和浸膏中鹽酸小檗堿含量所占權重分別為0.4 和0.6，綜合評分=出膏率得分+鹽酸小檗堿含量得分［4］。正交試驗設計與結果見表2。方差分析結果見表3。

表1 因素與水平Tab.1 Factors and levels of L9（33） orthogonal test

表2 L9（33）正交試驗設計與結果（n=9）Tab.2 Design and results of L9（33）orthogonal test（n=9）

表3 正交試驗方差分析結果Tab.3 ANOVA results of orthogonal test

結果分析：由表2 可知，各因素對指標影響程度由大至小依次為C > A > B，各因素對提取工藝的影響次序為A1>A2>A3，B1>B3>B2，C3>C2>C1。由方差分析結果可知，提取次數對提取結果有顯著影響，提取時間在F0.1水平對提取結果有顯著影響，加溶劑量對提取結果無顯著影響。最終確定處方藥材最佳提取工藝為A1B1C3，即加8倍量處方藥材溶劑，回流提取3次，每次1 h。

最佳提取工藝驗證：按10 倍處方量稱取藥材2 份，按最佳提取工藝進行平行驗證試驗，計算得平均出膏率為23.38%，提取浸膏中鹽酸小檗堿含量為89.49 mg/g，說明優選的提取工藝合理、穩定、可行。

2.2.2 成型工藝研究

基質選擇：根據處方藥物的性質、常用基質的特點，本研究中選擇評價以含藥栓外觀形狀、硬度、融變時限為評價指標，以36型、38型、36型 +38型（1∶1，m/m）混合脂肪酸甘油酯為栓劑基質進行考察，根據所得栓劑的外觀形狀是否光滑圓整、硬度是否適中、融變時限是否符合規定，選擇合適的基質。由表4可知，36型+38型混合脂肪酸甘油酯按1∶1（m/m）混合時所得的栓劑外觀均勻，軟硬適中，融變時限符合2020 年版《中國藥典（四部）》規定。故選擇基質為36型+38型混合脂肪酸甘油酯（1∶1，m/m）。

表4 基質篩選Tab.4 Screening of the matrix

置換價測定：取36 型、38 型混合脂肪酸甘油酯各10 g，70 ℃加熱熔融后制成不含藥粉的空白栓10 粒，稱定質量。取36型、38型混合脂肪酸甘油酯各7 g，加熱熔融，根據處方量稱取浸膏粉4.25 g，少量多次加入，不斷攪勻，于40 ℃注模，-5 ℃冷卻20 min，脫模取出，制成含藥粉栓劑10粒，稱定質量。按公式計算本處方的置換價（DV），DV=W/［G-（M-W）］。其中，G為空白栓的平均質量；M為含藥栓的平均質量；W為每枚栓劑的平均含藥質量。按G為 1.696 3 g，M為 1.814 9 g，W為0.425 0 g，計算得DV為1.39。按公式X=（G-W/DV）×n（n為預制栓劑枚數）計算制備含藥栓所需基質的質量。若制備100 枚四黃栓劑，需加入理論基質質量為140 g，即36型、38型混合脂肪酸甘油酯各70 g。實際操作中可能會有損失，故基質使用量暫定為150 g，即36型、38型混合脂肪酸甘油酯各加入75 g。

2.2.3 四黃栓制備［5］

取浸膏粉、冰片，研細，過100 目篩，按處方量稱取浸膏粉42.5 g，冰片12.5 g，備用。取36 型、38 型混合脂肪酸甘油酯各75 g，置燒杯中，于70 ℃水浴加熱融化，少量多次加入浸膏粉，不斷攪勻，待溫度降至45 ℃時加入冰片，攪勻，于40 ℃條件下注模，-5 ℃冷卻20 min，取出，刮去溢出模口部分，脫模，即得四黃栓（批號分別為2021022101，2021022102，2021022103）。

2.3 四黃栓質量標準研究

2.3.1 薄層色譜鑒別

大黃：取同一批（批號為2021022103）樣品10枚，將樣品切成小塊，混勻，取1.8 g（相當于1 枚栓劑的量），置錐形瓶中，加入甲醇100 mL，超聲處理（功率為80 W，頻率為50 kHz）45 min，濾過，吸取5 mL 濾液，水浴加熱蒸干，殘渣加10 mL 純化水，攪拌溶解，加入1 mL 鹽酸，水浴加熱回流45 min，取出，冷卻至室溫，轉移至分液漏斗，加20 mL 乙醚，振搖萃取，重復2 次，合并乙醚液，水浴蒸干，加入1 mL 三氯甲烷使溶解，濾過，即得供試品溶液［6］。取大黃對照藥材2 g，按供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。取大黃酸對照品適量，加甲醇溶解，制成質量濃度為10 mg/mL 的對照品溶液［1］。按處方制備缺大黃的陰性對照藥材，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 薄層色譜法進行試驗，將上述4 種溶液分別點于同一硅膠H 板（黏合劑為羧甲基纖維素鈉）上，點樣量為5 μL，展開劑為石油醚（37 ℃）-乙酸乙酯-甲酸（15∶5∶1，V/V/V）的上層液，展開，烘干，用3%三氯化鋁顯色，置紫外光燈（365 nm）下檢視［1］。供試品溶液、對照品溶液、對照藥材溶液色譜在相應位置顯相同的粉紅色熒光斑點，且缺大黃的陰性對照品溶液色譜無此斑點。詳見圖1 A。

黃連、黃柏［1］：取同一批（批號為2021022103）樣品10枚，切成小塊，混勻，取1.8 g（相當于1枚栓劑的量），置錐形瓶中，加100 mL 75%乙醇溶液，超聲處理（功率為120 W，頻率為65 kHz）45 min，放入 - 5 ℃冰箱冷凍4 h，搖勻，濾過，取續濾液2 mL，加甲醇 - 鹽酸溶液（100∶1，V/V）稀釋，定容于10 mL 容量瓶中，制得供試品溶液。取黃連、黃柏對照藥材粉末（過20目篩）各0.5 g，精密稱定，置三角瓶中，加100 mL 75%乙醇溶液，超聲處理（功率為120 W，頻率為65 kHz）45 min，靜置，濾過，取濾液20 mL，水浴蒸干，加2 mL 甲醇- 鹽酸溶液（100∶1，V/V）使溶解，即得對照藥材溶液。取鹽酸小檗堿對照品，精密稱定，加甲醇 -鹽酸溶液（100∶1，V/V），搖勻，完全溶解，即得質量濃度為0.19 mg/mL 的鹽酸小檗堿對照品溶液。按處方制備缺黃連、黃柏的陰性對照藥材，按供試品溶液制備方法制備缺黃連、黃柏的陰性對照品溶液。照2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 薄層色譜法進行試驗，吸取上述5 種溶液各適量，點于同一硅膠G 板上，點樣量為5 μL，先用濃氨試液預飽和10 min，展開劑為氨水-甲苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇（12.5∶6∶3∶2∶1.5，V/V/V/V/V），展開，取出，烘干，置紫外光燈（365 nm）下檢視［1］。供試品溶液與鹽酸小檗堿對照品溶液、黃連對照藥材溶液、黃柏對照藥材溶液、缺黃連陰性對照品溶液和缺黃柏陰性對照品溶液色譜在對應位置顯相同的熒光綠色斑點；黃連對照藥材和缺黃柏陰性對照品溶液色譜中還有2 個亮黃色的斑點，黃柏對照藥材和缺黃連的陰性對照品溶液色譜中無亮黃色斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

圖1 薄層色譜圖（365 nm）1.Reference solution 2.Test solution 3.Negative reference solution 4，4′.Phellodendri Chinensis Cortex and Coptidis Rhizoma reference medicinal materials solution 5，5′.Negative reference solution lacking Phellodendri Chinensis Cortex and Coptidis RhizomaA.Rhei Radix et Rhizoma B.Coptidis Rhizoma and Phellodendri Chinensis Cortex C.Scutellariae RadixFig.1 TLC chromatograms（365 nm）

黃芩：取同一批（批號為2021022103）樣品10枚，計算平均裝量，將樣品切成小塊，混勻，取1.8 g（相當于1 枚栓劑的量），置錐形瓶中，加75%乙醇100 mL，超聲處理（功率為120 W，頻率為65 kHz）45 min，溶解，濾過，濾液水浴蒸干，殘渣加甲醇5 mL使溶解，濾過，即得供試品溶液［1］。稱取黃芩對照藥材1 g，參照供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。取黃芩苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶液，搖勻，使完全溶解，制成質量濃度為1 mg/mL 的黃芩苷對照品溶液。按處方制備不含黃芩的對照陰性藥材，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液［1，7］。參照2020年版《中國藥典（四部）》通則0502薄層色譜法進行試驗，將上述4種溶液分別點于同一硅膠H板（65 ℃烤箱烘烤30 min）上，點樣量為3 μL，先預飽和15 min，以正丁醇 - 冰醋酸 - 水（7∶1∶2，V/V/V）為展開劑，展開，烘干，噴顯色劑三氯化鐵，顯色，置紫外光燈（365 nm）下檢視［8］。供試品溶液與對照藥材溶液、對照品溶液色譜對應位置上顯相同的橘黃色斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1 C。

2.3.2 鹽酸小檗堿含量測定

1）色譜條件［1］

色譜柱：Phenomenex C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液（每100 mL中加0.4 g 十二烷基硫酸鈉，加磷酸調pH 至4.0）- 乙腈（50∶50，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：345 nm；進樣量：10 μL。

2）溶液制備

取鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加甲醇-鹽酸溶液（100∶1，V/V）超聲（功率為120 W，頻率為65 kHz）20 min 至完全溶解，配制成質量濃度為200.97 μg/mL的對照品溶液。取樣品10 枚，切碎混勻，取0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇 -鹽酸溶液（100∶1，V/V）100 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率為120 W，頻率為65 kHz）45 min，放至室溫，加甲醇 - 鹽酸溶液（100∶1，V/V）補足減失的質量，放入-5 ℃冰箱內冷凍4 h，待基質全部析出，取出，搖勻，迅速濾過，濾液放至室溫，用甲醇 - 鹽酸溶液（100∶1，V/V）稀釋5 倍，即得供試品溶液［9］。按處方工藝稱取缺黃連、黃柏的其余藥材，按四黃栓制備方法制備空白栓劑，按供試品溶液制備方法制備缺黃連、黃柏的陰性對照品溶液。

3）方法學考察

專屬性試驗：分別取對照品溶液和供試品溶液各適量，按2.3.2項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果鹽酸小檗堿峰的理論板數不低于3 000，陰性對照品溶液中無干擾峰出現，對照品溶液與供試品溶液中，鹽酸小檗堿峰的保留時間一致，鹽酸小檗堿峰周圍無干擾峰，分離度好，方法專屬性良好。色譜圖見圖2。

圖2 高效液相色譜圖1.Berberine hydrochlorideA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solution lacking Coptidis Rhizoma and Phellodendri Chinensis CortexFig.2 HPLC chromatograms

線性關系考察：取溶液制備項下對照品溶液，加甲醇 - 鹽酸溶液（100∶1，V/V）分別稀釋至質量濃度為10.049，20.097，40.194，60.291，80.388，100.485 μg/mL的系列溶液，按2.3.2 項下色譜條件分別進樣測定。以峰面積（Y）為縱坐標、鹽酸小檗堿質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=43 307X+17 865（R2=1.000 0，n=6）。結果表明，鹽酸小檗堿質量濃度在10.049～100.485 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

日內、日間精密度試驗：分別取線性關系考察項下鹽酸小檗堿對照品溶液（質量濃度為60.291，10.049 μg/mL），按擬訂色譜條件1 d 內連續重復進樣6 次；連續3 d，每天進樣測定2次。結果鹽酸小檗堿峰面積的平均值分別為 2 637 859 和 444 360，RSD分別為 0.06% 和 0.16%（n=6），表明儀器日內、日間精密度良好。

重復性試驗：取同一批（批號為2021022103）樣品10 枚，切碎，取6 份，每份 0.5 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，按2.3.2 項下色譜條件進樣測定。結果鹽酸小檗堿含量的平均值為18.78 mg/ g，RSD為0.41%（n=6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取重復性試驗項下供試品溶液，按2.3.2 項下色譜條件分別于4，8，12，16，20，24 h 時進樣測定。結果峰面積的平均值為834 180，RSD為0.19%（n=6），表明供試品溶液在室溫下24 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：取鹽酸小檗堿含量為18.82 mg/g的樣品（批號為20210212103）6份，精密稱定，根據栓劑樣品中鹽酸小檗堿含量，按1∶1（m/m）加入對照品溶液，依法制得供試品溶液，按2.3.2 項下色譜條件進樣測定。結果見表5。

表5 鹽酸小檗堿加樣回收試驗結果（n=6）Tab.5 Results of recovery test of berberine hydrochloride（n=6）

4）樣品含量測定

取3 批樣品，各10 枚，切碎，依法制備供試品溶液，擬訂色譜條件進樣測定，并計算含量。結果見表6。以本品中含黃連、黃柏以鹽酸小檗堿計，暫訂本品質量標準確定的含量限度，不得少于18.58 mg/g。

表6 樣品含量測定結果Tab.6 Results of content determination of samples

3 討論

3.1 含量測定指標性成分選擇

中藥復方制劑成分復雜，通常只對主要有效成分進行定性、定量鑒別［10］。四黃栓由大黃、黃芩、黃連、黃柏等中藥組方，具有清熱利濕、活血化瘀、消腫止痛功效，用于治療痔瘡及肛門各種炎癥。黃連、黃柏中主要抑菌成分為小檗堿，選取小檗堿為主要代表成分進行含量測定以保證藥栓的藥效，同時參照2020年版《中國藥典（一部）》黃連羊肝丸、黃連上清片、清胃黃連丸（水丸）等復方中成藥的含量測定方法［7］。故選擇鹽酸小檗堿作為含量測定的指標性成分。

3.2 正交試驗考察指標選擇

藥材的提取出膏率是衡量中藥材提取是否完全和有效成分是否完全轉移的重要指標，也是提取工藝優化的重要考察指標。中藥復方制劑成分較復雜，單一指標往往不能衡量工藝的好壞，有效成分含量常作為提取浸膏考察指標。故選擇出膏率和主要活性成分鹽酸小檗堿的含量作為提取工藝正交試驗的綜合評價指標。

3.3 供試品溶液配制溶劑選擇

從基質中提取分離有效成分是供試品溶液處理的關健，同時還要最大程度地降低基質對儀器測定的干擾［11-12］。本研究中四黃栓使用的基質為36型+38型混合脂肪酸甘油酯（1∶1，m/m），溶于甲醇、乙醇，不溶于水。因此，在制備供試品溶液時，先測定目標成分的極性和酸堿性等。提取堿性成分時，先用酸性試劑提取，再用酸水使其游離，最后用適當極性的有機溶劑反復萃取，達到除雜的目的。本研究中采用甲醇、75%乙醇提取栓劑中有效成分，薄層鑒定結果良好［13-14］。供試品溶液配制過程中，加甲醇-鹽酸溶液（100∶1，V/V）超聲（功率為300 W，頻率為54 kHz，20 ℃）處理1 h，基質和鹽酸小檗堿完全溶解，加鹽酸有助于游離鹽酸小檗堿，放入- 0.5 ℃冰箱內冷凍4 h，基質全部析出，可達到去除基質的目的。

3.4 定性鑒別條件選擇

黃連、黃柏的薄層鑒別時，鹽酸小檗堿熒光綠色斑點下方存在黃色斑點，曾用不同展開劑分離斑點，但分離效果不理想。最終以氨水-甲苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇（12.5∶6∶3∶2∶1.5，V/V/V/V/V）為展開劑，因鹽酸小檗堿呈堿性，在展開槽另一邊放置等體積的濃氨試液飽和10 min 后再展開，可明顯改善斑點的形狀，但飽和時間不能過長，否則其斑點會呈扁圓形，甚至變為一條短線［15］。黃芩薄層鑒別時，因黃芩苷具有一定酸性，故展開劑中需要添加酸性成分，以減少拖尾現象［16］。參照2020 年版《中國藥典（一部）》黃芩薄層鑒別項下方法，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶1∶2，V/V/V/V）為展開劑，斑點基本分離，但可能由于展開劑極性太小，黃芩苷的比移值過小，斑點基本處于基線，達不到分離要求。通過調整展開劑的酸度、極性等，分離效果、拖尾現象明顯改善，結合文獻［8］，以正丁醇-冰醋酸 - 水（7∶1∶2，V/V/V）為展開劑，噴以三氯化鐵顯色，進行黃芩薄層色譜鑒別。結果黃芩苷對照品溶液色譜斑點與供試品溶液色譜中黃芩苷的斑點在一條直線上，顯色結果明了、直觀，容易判斷。

3.5 含量測定方法選擇

2020 年版《中國藥典（一部）》中黃連、黃柏含量測定項下測定鹽酸小檗堿含量的色譜條件中，流動相均采用0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（每100 mL 中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，加磷酸調節pH至4.0）-乙腈（50∶50，V/V），黃連和黃柏中小檗堿的檢測波長分別為345 nm和265 nm［1］。查閱文獻［17-20］，以保留時間和分離度為指標，反復調整流動相系統。十二烷基硫酸鈉（每100 mL含0.4 g）在0.05 mol/ L 磷酸二氫鉀溶液中不易溶解，需加熱才能溶解，但冷卻后又析出形成渾濁液。將磷酸二氫鉀換成磷酸二氫鈉，調整流動相比例［0.05 mol/L磷酸二氫鈉 - 乙腈（50∶50，60∶40，55∶45，V/V）］和流速（0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mL/ min），鹽酸小檗堿峰與雜質峰分離較好。最終采用本研究中確定的色譜條件。