Klotho基因在不典型膜性腎病患者中的表達意義及對OPN水平、 血栓彈力圖的影響①

趙翠，賈利敏，王自強，房曉芳，魏迪，郭鐵標，陳保春

滄州市人民醫院 醫專腫瘤院區， 腎病內科， 河北 滄州 061000

膜性腎病依據發病機制可分為不典型膜性腎病、 原發性膜性腎病、 繼發性膜性腎病等， 臨床表現為腎病綜合征(大量蛋白尿、 低蛋白血癥、 高度水腫、 高脂血癥)， 或無癥狀、 非腎病范圍的蛋白尿， 病程中可出現腎功能不全、 高血壓等． 不典型膜性腎病是指病因不明確的膜性腎病， 且患者患病率明顯升高[1]．Klotho基因是一種與衰老有關的基因， 研究顯示其與腫瘤細胞生長、 轉移、 凋亡等均有一定關系， 但其對腎病患者的作用機制尚不清楚[2]． 血清骨橋蛋白(OPN)可由人體內多種細胞合成分泌， 可積極調節機體器官組織的發育[3]． 此外， 腎病綜合征患者常見血液高凝狀態， 血栓彈力圖指標可準確檢測患者凝血因素異常情況[4]． 本研究利用免疫組織化學法對Klotho基因mRNA表達情況進行檢測， 并探討其對患者OPN、 血栓彈力圖的影響．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

設2018年1月至2020年1月滄州市人民醫院醫專腫瘤院區腎內科收治的100例腎穿刺活檢標本診斷為不典型膜性腎病患者為觀察組， 同時納入30例尸解未出現明顯腎臟病變的腎組織標本為對照組． 觀察組標本經福爾馬林固定， 行石蠟包埋切片； 對照組標本經2.5%戊二醛進行固定， 使用Epon包埋． 本研究已獲滄州市人民醫院倫理委員會通過(倫批2017025)．

1.2 方法

1.2.1 染色

Klotho免疫組化染色試劑盒購自賽默飛世爾， 對照組使用PBS溶液代替一抗． 嚴格按照說明書進行染色： ①脫蠟至水； ②使用蒸餾水配制3%甲醇過氧化氫(H2O2)20 mL， 并使用蒸餾水洗3次； ③使用微波抗原修復； ④滴加兔抗人一抗， 4 ℃下過夜， 使用PBS溶液洗3次； 滴加生物素化山羊抗兔IgG， 室溫下反應1 h， 使用PBS溶液洗3次； ⑤滴加SABC復合物， 室溫下反應1 h； ⑥加入DAB試劑， 使用蘇木素復染， 脫水封片．

Klotho基因mRNA原位雜交試劑盒購自賽默飛世爾， 嚴格按照說明書進行操作： ①石蠟切片后經酒精脫蠟入水， 加入3% H2O2室溫下反應10 min， 使用蒸餾水洗2次； ②滴加3%檸檬酸1 mL及2滴濃縮胃蛋白酶， 于37 ℃下反應15 min， 使用PBS溶液進行清洗， 共3次， 5 min/次， 蒸餾水清洗1次； ③滴加預雜交液， 于37 ℃下反應3 h， 滴加雜交液， 于37 ℃下反應過夜， 使用SSC進行清洗； ④于37 ℃下滴加封閉液， 30 min后甩去多余液體， 并滴加SABC溶液， 37 ℃下反應30 min， 使用PBS溶液洗4次， 5 min/次； ⑤滴加生物素化過氧化物酶， 37 ℃下反應30 min， 使用PBS溶液清洗4次， 5 min/次； ⑥DAB顯色10 min， 加入蘇木素復染， 脫水封片．

1.2.2 圖像分析

對兩組患者免疫組化染色切片及雜交染色切片進行檢測， 檢測范圍為腎小管及腎小球． 每張切片隨機選取3～5個腎小球， 并選取3個視野進行檢測， 分別檢測腎小球及腎小管的吸光度值， 并以平均值進行計算．

1.2.3 分組

根據觀察組細胞染色強度與陽性細胞比例進行計分， 染色強度可以分為0～3分， 0分為陰性； 1分為淡黃色顆粒； 2分為棕黃色顆粒； 3分為褐色顆粒． 陽性細胞水平評分： 0分： 陽性細胞R≤5%； 1分： 5%75%． 將兩項分數相乘得到分組標準， 將乘積M≤4分記為陰性組， 其余記為陽性組．

1.2.4 OPN水平及血栓彈力圖

使用3%H2O210 mL， 高壓鍋抗原修復3～5 min， 使用4 ℃一抗孵育過夜， 加入二抗進行37 ℃孵育15 min， 加入氧化物酶液-鏈霉素抗生物素進行37 ℃孵育15 min． 加入DAB顯色， 使用蘇木素染色1 min， 加入0.5%～1.0%鹽酸乙醇進行分化， 脫水封片．

使用WITEYE T10000血栓彈力圖分析儀(武漢中科和信生物技術有限公司)檢測陰性組、 陽性組血栓彈力， 檢測指標包括凝血時間、 凝血指數、 最大血栓彈力度、 凝固角．

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 兩組Klotho基因蛋白量比較

對照組腎小管上皮細胞僅為微弱陽性反應， 陽性顆粒僅見于腎小管上皮細胞胞漿內； 腎小球為陰性反應， 腎小球間質內未見明顯陽性反應． 觀察組患者Klotho基因呈強陽性表達， 與對照組相比， 差異有統計學意義(p<0.05)， 見表1．

表1 兩組Klotho基因蛋白量比較

2.2 兩組Klotho基因mRNA原位雜交染色比較

對照組腎小球未見Klotho基因mRNA陽性表達， 腎小管見極弱陽性表達． 觀察組腎小管上皮細胞呈強陽性表達(p<0.05)， 腎小球與對照組相比差異無統計學意義(p>0.05)， 見表2．

表2 兩組Klotho基因 mRNA原位雜交染色比較

2.3 陰性組及陽性組OPN蛋白表達情況比較

陽性組有82例， 陰性組有18例． OPN主要在血管內皮、 血管平滑肌、 腎小管粘膜上皮等上表達． 陽性組OPN蛋白表達水平遠高于陰性組， 組間數據相比差異有統計學意義(p<0.05)， 見表3．

表3 陰性組及陽性組OPN蛋白表達情況比較

2.4 陰性組及陽性組血栓彈力圖檢測結果比較

陽性組凝血指數、 最大血栓彈力度、 凝固角顯著高于陰性組， 凝血時間顯著低于陰性組， 組間數據相比差異有統計學意義(p<0.05)， 見表4．

表4 陰性組及陽性組血栓彈力圖檢測結果比較

3 討論

不典型膜性腎病常為隱匿起病， 患者主要病理表現為腎小球基底膜增厚伴有上皮細胞下免疫復合物沉積， 主要表現為高血壓、 腎功能不全等． 患者常處于血液高凝狀態， 因此血栓栓塞是其常見并發癥[5-6]． 目前臨床上發現不典型膜性腎病患者治療效果較差， 因此積極探討其發病機制及臨床生理特點是研究的重點所在．

本研究共收集100例不典型膜性腎病患者腎穿刺活檢標本， 并對其Klotho基因進行研究．Klotho基因是一種與衰老有關的基因， 有研究指出， 小鼠缺乏Klotho基因后會出現骨質疏松、 肺氣腫、 動脈硬化等綜合征[7]． 李莉等[8]研究指出， 大鼠心、 腎組織Klotho基因表達水平降低， 會影響其內皮功能， 從而影響腎臟功能． 鄒新蓉等[9]研究發現， 大鼠腎損害氧化應激反應與Klotho基因水平有關， 通過使用抗氧化藥物可有效上調Klotho基因的表達水平， 從而減輕大鼠的臨床癥狀． 同時， 許多研究結果發現，Klotho基因蛋白表達水平升高時可保護腎臟[10]． 邵齊等[11]在培養的腎小球細胞中加入Klotho基因后， 發現上皮細胞合成纖維連接蛋白明顯增多， 提示Klotho基因可刺激腎小球上皮細胞合成細胞外基質． 本研究結果顯示， 對照組腎小管上皮細胞僅為微弱陽性反應， 陽性顆粒僅見于腎小管上皮細胞胞漿內， 腎小球為陰性反應， 腎小球間質內未見明顯陽性反應， 觀察組患者Klotho基因mRNA表達呈強陽性(p<0.05)． 此外，Klotho基因蛋白表達不僅在腎小球， 同時在腎小管上皮細胞胞漿內也有表達， 提示Klotho基因對腎小管、 腎小球均有一定影響[12]． 同時， 本研究結果顯示Klotho基因mRNA表達水平在腎小管內表達水平較腎小球內更明顯， 與王健富等[13]研究結果一致． 有研究表明[14]， 對腎病患者腎臟中Klotho基因mRNA表達水平檢測中發現， mRNA表達水平主要分布于人腎小管及集合管上皮細胞內， 且陽性信號高于腎小球． 本研究結果提示患者出現腎小管的改變可能對腎間質纖維化起到重要作用． 董照瀛等[15]研究發現自發性高血壓大鼠體內Klotho基因mRNA表達水平上調， 可導致大鼠心肌膠原纖維化水平、 心肌細胞厚度、 高血壓腎損害明顯減少， 提示Klotho基因還可減緩心臟損害．

OPN是一種位于常染色體上的蛋白質， 且存在于人體內不同組織及不同細胞中． 邢艷陽等[16]指出， OPN表達受到雌激素及孕酮的影響． 龐春艷等[17]指出， 表皮生長因子可通過特定的信號途徑調控OPN mRNA表達． OPN主要通過依賴特定序列與細胞表面特異受體進行結合， 從而直接或間接促進淋巴細胞、 巨噬細胞的趨化作用， 從而誘導巨噬細胞分化IL-12等． 黃雨茅等[18]通過建立不典型膜性腎病模型發現， OPN在腎小管間質受損區域表達上調， 同時有大量巨噬細胞浸潤． 孔繁達等[19]通過動物研究證實， 腎小管間質中OPN表達增加可促進巨噬細胞浸潤， 從而加快腎小管損傷， 加重體內炎癥反應． 本研究根據Klotho基因mRNA陽性細胞數及染色強度將觀察組分為陽性組(82例)和陰性組(18例)， 結果顯示OPN主要表達于血管內皮、 血管平滑肌、 腎小管粘膜上皮等， 陽性組OPN蛋白表達水平遠高于陰性組(p<0.05)． 此外， 有研究[20]指出， OPN水平與腫瘤的轉移與發展有重要關系， OPN在腎臟腫瘤患者中表達明顯增加． 但OPN與腎臟腫瘤患者中的表達水平尚無足夠臨床研究． 但劉明等[21]指出， OPN與MMP-2因子的表達有一定關系， 且對腫瘤良惡性有一定指征反應， 因此可使用OPN水平初步對腎臟腫瘤患者進行篩選等．

腎病綜合征患者常見血液高凝， 因此臨床上常使用血栓彈力圖對血凝狀態進行檢測， 從而動態評估血液凝塊、 纖維蛋白的形成， 并積極反應血凝塊的動態變化[22]． 本研究顯示， 陽性組凝血指數、 最大血栓彈力度、 凝固角顯著高于陰性組， 凝血時間顯著低于陰性組(p<0.05)， 提示Klotho基因陽性表達組患者凝血狀態較陰性組異常程度更高． 血管內皮細胞在受損狀態下會合成并分泌一種叫內皮素的物質， 從而產生強烈的縮血管反應， 引起動脈收縮、 腎功能受損、 高凝狀態等， 而Klotho基因mRNA此時在腎的表達減少， 而內皮素蛋白表達增加， 從而加劇了病情的發展[23-24]．

本研究由于條件有限， 樣本數較小， 同時觀察組患者進行腎穿刺活檢時可能由于時機不同對結果產生了一定的影響． 因此， 進一步研究還需加強對患者的隨訪， 密切關注患者Klotho基因表達情況與治療效果的關系， 從而增加對疾病機制的認知， 改善患者預后效果． 綜上所述，Klotho基因mRNA表達水平在不典型膜性腎病患者中顯著升高， 且會升高患者OPN水平， 并影響血液凝固狀態．