細菌纖維素/明膠復合止血海綿的制備與性能研究

萬 嘉，吳擢彤，王寶秀，韓志良，陳仕艷

(東華大學材料科學與工程學院，纖維材料改性國家重點實驗室，上海 201620)

血液是人體的重要組成部分，在人體內起到運輸營養物質和廢物、調節人體滲透壓和酸堿平衡、調節體溫等功能[1]。研究表明，過度失血導致的死亡占全世界死亡率的30%[2]。因此，若是能夠在救援人員到達之前使用高效的止血材料快速止血，減少傷者血液流失，其存活率可大大提高。

BC具有純度高、可再生、生物相容性好等優良特性[3]，廣泛應用于醫用材料。由于BC具有很強的分子間氫鍵及高結晶度[4]，這使其具有良好的力學性能，如高拉伸強度和彈性模量[5]，可以應用于各種復合材料中提升其力學性能[6]。目前已有許多學者將其作為增強材料應用于聚合物復合材料的合成與制備中，得到了性能優異的復合材料[7]。明膠海綿是一種常見的醫用止血材料，具有疏松的三維立體多孔結構，可以吸收傷口處的血液，自身體積膨脹對傷口進行機械壓迫或填塞，達到止血效果，但明膠止血海綿的結構疏松，力學性能不好，用作敷料時創面的黏合能力不強[8]。

因此，本研究使用EPTAC對BC進行季銨化改性[9]，使BC可以通過陽離子凝聚血紅細胞形成血栓促進止血，將其與明膠(Gel)進行復合制備止血海綿，以改善明膠海綿多孔結構帶來的力學性能差的問題。在控制海綿良好的壓縮性能以及吸水性能的同時，具有良好的抗菌性能。

1 試 驗

1.1 原料與試劑

BC，CP，上海奕方農業科技股份有限公司；EPTAC，RG，上海泰坦科技股份有限公司；氫氧化鈉，AR，平湖化工試劑廠；異丙醇，AR，上海沃凱生物技術有限公司；無水乙醇，AR，上海凌峰化學試劑公司；1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，AR，北京百靈威科技有限公司；N-羥基琥珀酰亞胺，AR，sigma-aldrich有限公司；抗凝兔血，BR，河南巨石生物科技有限公司；明膠，CP，國藥集團化學試劑有限公司；2-(N-瑪琳代)乙磺酸，AR，國藥集團化學試劑有限公司；戊二醛，BR，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器設備

場發射掃描電鏡，S4800型，Hitachi公司；傅里葉紅外光譜儀，Nicolet-670型，Spectrometer公司；納米粒度儀，Malvern Instruments Ltd型，Malvern公司；紫外分光光度計，Evolution 201型，Spectrometer公司；電子萬能材料試驗機，Instron 5969型，Instron公司。

1.3 試驗過程

1.3.1 纖維素季銨化

稱取1 g BC(干重)加入10 mL去離子水和30 mL 異丙醇分散，再加入20 mL質量分數10%的氫氧化鈉溶液，于65 ℃下加入9 g EPTAC，在磁力攪拌條件下反應10 h。將反應體系溶液多次高速離心，洗滌，得到季銨化BC，記為CABC。

1.3.2 復合海綿的制備

稱取明膠溶解，與CABC混合，制備成固含量為2%的復合溶液，充分混合后脫泡，置于培養皿中冷凍干燥，制得不同比例的復合海綿，CABC與明膠的比例分別為4∶6、5∶5、6∶4。

1.3.3 復合海綿的交聯

稱取等摩爾量的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶于pH為5.5的0.5 mol/L的MES緩沖液和乙醇混合溶液中，MES緩沖液與乙醇體積比為3∶2，制得交聯液。將復合海綿浸泡于之前配置好的交聯液中，浸泡24 h后，用去離子水清洗直至完全去除交聯液后冷凍干燥得到復合海綿。

1.4 分析測試

1.4.1 吸水率測量

將制得的復合海綿干燥稱重，然后將其在去離子水中浸泡5 min，吸去表面水分后稱重，根據公式計算其吸水率，公式如下[10]：

(1)

式中W為吸水率，%；M1為干燥樣品質量，g；M2為充分浸濕樣品質量，g。

1.4.2 孔隙率測量

將制得的復合海綿干燥稱重，然后將其浸沒于盛滿乙二醇溶液的密度瓶中，除去氣泡，再加滿乙二醇，用濾紙拭去密度瓶表面的乙二醇并稱重，取出樣品稱重，根據公式計算其孔隙率，公式如下[11]：

(2)

式中P為材料孔隙率，%；M1為干燥樣品質量，g；M2為充分浸濕樣品質量，g；M3為裝滿乙二醇的密度瓶質量，g；M4為裝有樣品和乙二醇的密度瓶質量，g。

1.4.3 凝血指數(BCI)測試

稱取10 mg海綿，37 ℃恒溫孵育，加入100 μL抗凝兔血和20 μL的0.2 mol/L的CaCl2溶液，5 min后加入25 mL蒸餾水，在37 ℃下以50 r/min的轉速恒溫搖勻，5 min后取出溶液，用紫外分光光度計測量其在波長545 nm下的吸光度值(abs)。設立不加入海綿作為對照組，BCI值計算公式如下：

(3)

式中abs樣品為實驗組的吸光度值，L/(g·cm)；abs對照為對照組的吸光度值，L/(g·cm)。

1.4.4 海綿的動態凝血測試

取10 mg海綿，37 ℃恒溫孵育，加入100 μL抗凝兔血和20 μL的0.2 mol/L的CaCl2溶液，分別在0、5、10、15、20、25和30 min時加入25 mL蒸餾水，在37 ℃恒溫50 r/min轉速下，搖勻后取出溶液，用紫外分光光度計測量其在波長545 nm下的abs。

1.4.5 海綿的血細胞吸附測試

取抗凝兔血，2 000 r/min離心，移去上層血漿，下層的紅細胞用PBS緩沖液稀釋到原來濃度的10%，海綿置于24孔板中，在37 ℃恒溫環境中孵育5 min，加入300 μL紅細胞稀釋液，在37 ℃恒溫環境中孵育30 min后，用PBS緩沖液洗掉未被吸附的紅細胞，用2.5%的戊二醛固定30 min，分別用40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%的乙醇溶液梯度洗脫15 min，最后樣品自然風干，噴金處理后用掃描電子顯微鏡觀察紅細胞的吸附情況。

1.4.6 海綿的抑菌性能測試

分別將革蘭氏陰性大腸桿菌、革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌于37 ℃下，在培養基中培養24 h，然后取細菌懸液與樣品在PBS緩沖液中震蕩培養24 h，分別稀釋100倍和1 000倍后均勻涂布于固體培養基上繼續培養24 h，統計培養基上的菌落數，計算其抗菌率η[12]，公式如下所示。

(4)

式中N0為對照組菌落數，個；N1為實驗組菌落數，個。

1.4.7 海綿的細胞毒性測試

將細胞置于加有海綿浸出液的培養基中培養24 h，然后使用CCK-8試劑對其細胞活性進行測量。計算公式如圖所示[13]：

(5)

式中R為細胞存活率，%；abs樣品為實驗孔吸光度值(培養過細胞的培養基、CCK-8、待測物質)，L/(g·cm)；abs空白為空白孔吸光度值(未培養細胞的培養基、CCK-8)，L/(g·cm)；abs陰性對照組為對照組吸光度值(培養過細胞的培養基、CCK-8、不含待測物質)，L/(g·cm)。

1.4.8 其他測試

采用傅里葉紅外光譜儀，溴化鉀壓片法對季銨化BC、純BC、EPTAC進行FT-IR測試，設定波長范圍為4 000～400 cm-1。

以去離子水為溶劑采用納米粒度儀對季銨化BC進行Zeta電位測量。

采用場發射掃描電鏡在加速電壓為15.0 kV的條件下對樣品的微觀形貌和結構進行表征。

使用電子萬能材料試驗機測量樣品的壓縮模量及壓縮循環，設定壓縮速率為10 mm/min，最大壓縮量為50%。

2 結果與討論

2.1 BC季銨化改性及表面電性

EPTAC、BC、CABC傅里葉紅外光譜圖如圖1所示。

圖1 EPTAC、BC、CABC傅里葉紅外光譜圖

通過比較CABC與BC的紅外光譜圖可知，經過改性后的CABC與BC仍然存在相似的峰型，但在1 480 cm-1附近出現一個吸收峰，對應EPTAC的CH3振動峰[14]。

使用Zeta電位來評估CABC的表面電性，如圖2所示。

圖2 BC、CABC的Zeta電位圖

從圖2可以看出，所得CABC的Zeta電位為40 mV，與純BC的Zeta電位-16.75 mV相比，季銨化改性后的BC帶有一定量的正電荷，帶同種電荷的CABC分子鏈產生相互排斥的靜電力，避免了纖維素納米纖維間的纏結發生，同時抵抗BC的重力使其均勻地分散在溶液中不發生沉降，這使得CABC在水中的分散性較好[15]。

2.2 吸水率和孔隙率分析

不同質量比的CABC/明膠復合海綿孔隙率、吸水率如圖3所示。

根據不同比例的CABC/明膠復合海綿的孔隙率、吸水率關系圖可以看出，隨著CABC含量由40%增加至60%，復合海綿的孔隙率由83.4%下降至70.45%，這是由于BC的納米纖維與明膠孔壁存在較強的界面作用力，隨著CABC含量的增加，其作用力增強，CABC/明膠復合海綿的結構也越加緊密，導致孔隙率下降。

由于隨著CABC含量的增加，復合海綿的孔隙率下降，其吸水率也由3 131%下降至2 463%，與孔隙率的變化趨勢相同。通過纖維素納米纖維的引入，可以調控明膠海綿的孔隙結構，從而控制止血過程中過多的血液流失，解決商用明膠海綿在臨床應用過程中血液流失過多的問題。

2.3 海綿微觀形貌觀察

在掃描電鏡下對不同比例的CABC/明膠復合海綿進行觀察，結果如圖4所示。

圖4 不同質量比的CABC/明膠復合海綿表面SEM圖CABC：明膠分別為4∶6(a、b)，5∶5(c、d)，6∶4(e、f)

從圖4(a、c、e)中可以看到復合海綿表面具有若干片狀結構堆疊，這使復合海綿具有一定的吸水性。當傷口出血時，復合海綿可以吸收流失的血液和組織液，發生輕微的膨脹壓迫傷口組織多余的生物流體流失，并同時提供濕潤的愈合環境。另外，從圖4(b、d、f)中可以看出，海綿內部孔壁的表面附著了大量的纖維素納米纖維，作為材料骨架為復合海綿提供了支撐作用，使其能夠適應更為復雜的臨床環境，而不至于塌陷變形。與單獨的明膠相比，納米纖維的引入提高了材料表面的粗糙度，提高了細胞的黏附[16]，使得復合海綿能夠黏附更多的血漿和血細胞，促進血液的凝結[17]。隨著CABC含量上升，復合海綿的孔徑逐漸減小，纖維素納米纖維也越發致密，這也是孔隙率和吸水率隨CABC含量下降而略有下降的原因。

2.4 海綿凝血情況分析

對復合海綿進行全血凝血指數分析，結果如圖5所示。

圖5 CABC/明膠復合海綿全血凝血指數

BCI反應材料的凝血性能，其數值越小，材料的凝血效果越好。通過測量，不同比例的CABC/明膠復合海綿的BCI分別為15.8%、10.3%、13.7%，其中質量比為5∶5的復合海綿數值最低，證明其凝血性能最好。這是因為質量比為4∶6復合海綿結構松散，孔洞太大，難以實現血液的吸附固定，使血液無法快速凝結，導致BCI過高；而質量比為6∶4的復合海綿的結構致密，孔徑較小，導致血液無法快速滲入海綿內部，只浮在海綿表面，無法促進血液凝結，導致BCI偏高。因此，質量比為5∶5的復合海綿BCI最小，凝血效果最好。

圖6為CABC/明膠復合海綿動態凝血分析。

圖6 CABC/明膠復合海綿動態凝血分析

通過動態凝血實驗觀察到在0～5 min內吸光度迅速下降，而后趨于平緩，這說明在5 min內復合海綿和純明膠海綿都促進了血液的快速凝結，隨著時間的增加，吸光度趨于平緩，這證明凝血過程基本完成。無論是何種比例的CABC/明膠復合海綿的吸光度都低于同時期的純明膠海綿，證明CABC的引入可以促進血液的凝固，綜合來看CABC與明膠質量比為5∶5的復合海綿凝血效果最好。

2.5 海綿的血細胞吸附

不同質量比的復合海綿的血細胞吸附SEM圖如圖7所示。

從圖中可以看出，質量比為5∶5的海綿血細胞吸附最多；質量比為4∶6海綿由于結構松散，孔洞太大，血細胞難以吸附固定；質量比為6∶4的海綿結構致密，孔徑較小，血細胞難以快速滲入海綿內部進行吸附固定，這與之前測量的全血凝血指數和動態凝血分析結果一致。

2.6 海綿的力學性能分析

對不同纖維素和明膠比例的復合海綿及明膠海綿進行了力學性能分析，應力應變曲線如圖8所示。

從圖8可以看出，與明膠海綿相比，復合海綿的壓縮應力有了較大的提高，質量比為4∶6、5∶5、6∶4的復合海綿壓縮模量(圖9)分別達6.96、8.56和6.17 kPa，是明膠海綿的壓縮模量(2.44 kPa)的3倍左右，這說明BC的引入對明膠海綿的三維多孔狀結構起到了支撐作用，達到了力學增強的效果。

圖9 不同質量比的復合海綿與明膠海綿的壓縮模量圖

選擇力學增強效果最好的質量比為5∶5的樣品，對其進行了壓縮循環性能測試，如圖10所示。

圖10 CABC與明膠質量比為5∶5的復合海綿壓縮循環圖

從圖10中可以看出，隨著應變的逐漸增加，應力也逐漸增加。在釋放壓力后，海綿可以回復到初始狀態。雖然在第一循環后應力稍微有點降低，但在隨后的壓縮循環中幾乎保持不變，說明能夠承受一定的變形，并具有良好的循環穩定性。

2.7 海綿的抑菌性能分析

對復合海綿進行了抗菌性能表征，如圖11、12所示。

圖11 復合海綿的抑菌實驗a) 大腸桿菌對照組；b) 實驗組；c) 金黃色葡萄球菌對照組；d) 實驗組

圖12 復合海綿對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率

從圖11可以看出，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌來說，實驗組的菌落數都顯著少于空白對照組的菌落數，這證明其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有一定的抑菌性，其抑菌率分別為65.0%、87.6%(圖12)這是因為N+陽離子的引入會與負電荷的細菌細胞膜表面產生靜電作用，導致膜表面電荷分布不均勻，使得細菌喪失正常生理功能，從而導致細菌死亡。止血海綿優異的抗菌性給予了海綿更大的應用潛力，在傷口的止血過程中，預防傷口感染是不可避免的問題，傳統的抗菌防感染的策略多是輔以藥物和抗菌劑，但無形中提高了材料的制作成本和應用難度，而具有本征抗菌能力的CABC以及其制備的復合海綿很好地彌補了這一缺陷，并為抗菌海綿的制備提供了新的研究思路和指導意義。

2.8 海綿的細胞毒性評價

對不同比例的復合海綿進行了的細胞活性表征，如圖13所示。

從圖13可以看出，CABC與明膠比例為4∶6、5∶5、6∶4的復合海綿的細胞活性分別為100%、90%、87%，根據GB/T 16886.5—2017醫療器械生物學評價第5部分：體外細胞毒性試驗要求，細胞活性下降大于30%被認為有細胞毒性反應。因此，可以認為制備的復合海綿無細胞毒性，具有用于生物體止血的應用基礎。細胞活性隨CABC含量上升而下降可能是因為接枝了陽離子的CABC在水中少量電離出陽離子對細胞活性產生影響。

3 結 論

a) 使用EPTAC對BC進行改性，成功制備出了CABC，陽離子的引入減少了BC之間的纏結，顯著提高了纖維素的分散性。

b) 成功制備了不同比例的CABC/明膠復合海綿，并對其止血性能、抗菌性能以及細胞毒性進行評估，結果表明CABC與明膠質量比為5∶5的海綿綜合性能最好。

c) BC與明膠具有良好的生物相容性，BC的引入很好的地改善了明膠海綿的力學性能，同時陽離子的引入增加了其抗菌性，在制備高效止血海綿方面具有良好的應用前景。