精準檢驗醫學和精準臨床免疫學

高慧雙　劉肖　程珍　寧永忠

摘要：隨著新的檢測技術的發展，新的醫學概念——即個體化醫學，又稱精準醫學，產生并迅速發展，同時也帶動了精準檢驗醫學概念的發展。本文主要闡述精準檢驗的一大分支——精準臨床免疫學檢測在各類疾病中的主要應用情況。

關鍵詞：精準檢驗醫學? 精準臨床免疫學? 高通量基因檢測（NGS）

[Abstract] With the development of new detection technology， a new medical concept-that is， individualized medicine， also known as precision medicine， has emerged and developed rapidly， and it has also led to the development of the concept of Precision Laboratory Medicine . This article mainly describes the main application of precision inspection， a major branch of precision laboratory Medicine， in various diseases.

[Key Words]? Precision Laboratory Medicine， Precision Laboratory Immunology， next-generation sequencing

隨著2012年世界衛生組織宣布人類基因組計劃完成，以及各種生物學檢測技術的飛速發展，臨床醫學診療模式正在發生劇變。即從以前的傳統醫學（經驗模式、循證醫學模式）向現代化醫學轉變。而醫學實踐也正迅速的從傳統的“視觸叩聽”的“疾病醫學”（即生病了來醫院就診）向更為先進前沿的“健康醫學”（即為預防疾病、尋求健康）轉型。我們稱之為“精準醫學”或“個體化醫學”、“personallized、predictive、preventive、participatory（4p）”醫學。2015年美國提出了精準醫學計劃，其計劃在短期內利用現有的基因庫用于癌癥的診療，遠期目標是建立更多疾病相關的連接且得以應用。于是，“精準”這一概念也成為了近年來討論比較多的一種新型的個性化醫療實踐方向——本質上是聚焦于個體的基因層面、分子層面。從某種程度上說，精準醫學可以稱為未來醫學發展的“雛形”。

一、精準檢驗醫學

精準檢驗醫學，“精準”顧名思義就是要在個體的基因、分子層面體現檢驗的“精確”和“準確”，做到有的放失。這一概念給目前的檢驗醫學提出了新的挑戰。新的理念也需要醫生在恰當的時機，給恰當的患者，開具恰當的檢查方法;而檢驗工作人員則運用恰當的輔助方法——尤其是基因檢測方法、分子檢測方法，提供恰當的檢驗數據，給醫生診療提供幫助。這一檢驗過程，層層相加，環環相扣，缺一不可，體現了“精準醫學”這一概念的內涵。

早在上個世紀70年代，精準醫學這一理念就已經初步體現——那時美國稱為“泡泡男孩”的一個小男孩，從出生便被診斷為嚴重聯合免疫缺陷病（SCID）。醫生根據其情況為了他制作了無菌膈膜房間，像一個“泡泡”一樣，可以讓他在里面與外界隔絕生活。雖然他在12歲時經骨髓移植治療后不幸去世。但可以說，正是由于醫生的個體化診療手段、精準施治，才讓這一患有重疾的孩子得到了個體化的治療，延續了寶貴的生命。

二、精準臨床免疫學

臨床免疫學檢驗作為檢驗醫學的一重要分支，在許多疾病的診斷、治療、防控等方面，提供了重要的依據，為臨床診療準確性提供了重要保障。在眾多免疫學檢測中，腫瘤、血液系統疾病、器官、骨髓移植、自身免疫性疾病、過敏性疾病等精準免疫學檢測，是臨床診斷和治療的重要環節。

眾所周知，惡性腫瘤是一種細胞惡性分裂增殖的全身性復雜性疾病。其發病率和死亡率高，給社會和家庭帶來了很大的社會和經濟負擔。目前臨床上常用的如CEA、CA125、CA199、AFP、CA72-4等腫瘤標志物在疾病的特異性診斷治療中，面對腫瘤的多樣性和異質性，給予臨床診療的指導性作用相對有限，且僅能提示腫瘤發生或復發的可能。引起腫瘤的病因復雜多樣，其中基因變異是有高度特異性和異質性的重要因素。在腫瘤的診療過程中，如何做到在“海量”的基因信息中精準的“打撈”出突變基因、致病基因，是精準臨床免疫學的難點。目前，高通量基因檢測（high-throughput sequencing），又稱為下一代測序技術NGS（next-generation sequencing）的發現和應用，解決了這一難題。采用高通量NGS技術手段，可以在龐大的未知序列信息條件下，迅速獲取患者的癌細胞特有的基因變異信息（包括突變、融合基因等），從而甄別出變異信息，針對基因變異的位點，針對性的提供治療方案。

例如，BRCA1和BRCA2是乳腺癌的兩個易感基因，BRCA基因突變的檢測可預測乳腺癌的患病風險。與散發性乳腺癌比較，BRCA1和BRCA2陰性的乳腺癌患者中，家族性乳腺癌≤30歲者所占的比例較高，且更易患雙側乳腺癌，提示該病存在著一定程度的遺傳易感性;在治療方面，有研究表明，BRCA1突變的患者對新的輔助化療更加敏感，除此以外，BRCA1和BRCA2陰性的家族性乳腺癌患者也對新輔助化療敏感。這些研究均為BRCA1和BRCA2陰性的家族性乳腺癌患者提供了新的個體化治療方向。同時，乳腺癌基因檢測可以將腫瘤的防治措施提前至易感階段而不是發病階段，這是個體化治療的一大有利方向，美國影星安吉麗娜朱莉，在其家族性乳腺癌的背景下，提前做了易感基因檢測，并且根據檢測結果提前采取了預防措施，可謂是個體化預防，未雨綢繆。

錯配修復基因MLH1、MSH2、MLH3等的突變可以是導致結腸癌、直腸癌發生的主要因素，且其表達與癌癥病理分化程度密切相關。研究證實，MLH1表達缺失的患者發病年齡更早，腫瘤體積大，右半結腸比例相對較高，且伴有更高的淋巴結清掃數目。治療方面，MLH3 rs175057與局部進展期直腸癌患者術前同步放化療的敏感性相關，攜帶該位點T等位基因的患者比攜帶C等位基因的患者對治療更敏感，而且這些患者的預后更好。MSH2 rs13019654位點與治療的敏感性相關，但與患者的總生存無關。而MSH2的3個SNP位點與患者的總生存相關，因此，這些基因突變位點可以作為預測直腸癌患者術前同步放化療敏感性的指標，而rs175057、rs3771273、rs10188090和rs10191478這4個位點可以作為預測直腸癌患者術前同步放化療后總生存的指標。在肺癌的診療中，KARS、EGFR等多種分型基因突變，使得醫生可以針對不同的基因突變位點制定相應的化療方案，使用分子靶向藥物，提高患者的生存期。

目前白血病等血液系統腫瘤的診斷和治療也邁入精準醫學時代。2012 年美國血液學會（American Society of Hematology，ASH）年會上關于測序（sequencing）的文獻共有 643 篇;其中，應用 NGS 的文章就多達220 篇，涉及到急性白血病、骨髓增殖性疾病、多發性骨髓瘤、淋巴瘤、再生障礙性貧血、止血與血栓疾病等各類血液疾病。新一代測序技術的使用，使得急性淋巴細胞白血病（ALL）中多種新的融合基因、基因突變等重現性分子學異常的診斷可以被檢測出來。同時，通過NGS手段可以精準的指導臨床選擇靶向藥物、評估預后分層以及急性淋巴細胞白血病（ALL）微小殘留病（MRD）等預后監測。例如檢測到NR3C1、CREBBP、TP53、NT5C2等基因突變，則提示ALL疾病的復發及耐藥。由此指導臨床精準治療。

HLA（ Human leukocyte antigen）分型技術目前已廣泛應用于實體器官移植、造血干細胞移植供受者組織相容性配型、造血干細胞捐獻者庫建設、藥物個性化選擇、群體遺傳多態性和某些疾病關聯等的研究。傳統的HLA基因分型技術使用的是HLA 核苷酸序列測定法 （ polymerase chain reaction-sequence based typing，PCR- SBT）。但由于HLA高度多態性、等位基因同源性等因素的影響，其在應用過程中存在一定的模糊制定問題。隨著HLA分型技術不斷深入發展，新一代測序平臺已應用于HLA基因分型，實現了高通量和快速精準檢測。并且可以有效的避免傳統PCR-SBT的技術限制。當然任何一種方法都不會完美無缺，有學者指出NGS在應用于HLA基因分型過程中存在一定程度的等位基因擴增不平衡和丟失現象。需要進一步發展來克服該弊端。

自身免疫性疾病 （AID） 是一大類與免疫系統功能障礙和異常免疫反應相關的不同病癥，是一種累及多器官多組織的一類全身性疾病。實驗室目前的檢測指標如抗核抗體譜、抗中性粒細胞抗體譜、抗心磷酯抗體等多指向特定的自身免疫疾病，但往往多年來，研究人員和臨床醫生一直在尋求特定的臨床和實驗室特征來定義自身免疫性疾病并更精確地進行診斷。精準醫學可以使用分子譜并獨立于臨床診斷來確定進行早期治療和預防組織損傷的方法。由于患者自身免疫狀況，相較于健康人群來說更易感染各類病原體，且往往合并重癥感染，在臨床治療方面，需要更大劑量種抗生素來治療。然而，自身免疫病患者體內免疫感染的致病菌較多，常規的培養檢定方法不能完全鑒別，往往耗時較長。此時，NGS方法得以應用，其優勢則體現出來，在此類患者標本中檢測致病菌，尤其是病毒或真菌時，其有這獨特的診斷敏感性、特異性和檢驗時效方面的優勢。

精準臨床免疫學在過敏性疾病中的應用是近幾年新興的精準方向。哮喘、鼻炎和特應性皮炎特應性皮炎、食物藥物過敏性疾病的傳統的治療往往依賴病史、臨床檢查和過敏源測試等的結果。而針對過敏性疾病的治療反應或疾病病程、患者自身的免疫狀態燈因素隨著時間推移，其個體臨床差異不盡相同，而傳統的“一刀切”模式的治療手段往往達不到預期效果。NGS等技術，結合體外功能測試，能夠極大地幫助我們了解特應性相關的潛在機制。而精準臨床免疫學則從病理生理學、遺傳學、藥理學、生理學、生物學和/或免疫學等多角度對病例進行詳細分析，基于每一例證據進行更具體的指導治療。例如，有研究表明，職業或環境中的低分子量物質導致上皮來源的TSLP、IL-33和IL-25的釋放，可啟動或加重2型免疫反應，從而加重Ⅱ型免疫反應性鼻炎。某些基因突變、遺傳變異、基因突變的表觀遺傳變化與食物過敏的早期發作有關。基于這些研究，可確定過敏分型、發生過敏的風險、過敏反應嚴重程度和治療預后的敏感和特異性生物標志物，由此導向精準治療。

綜上，以NGS檢測技術為依托的精準臨床免疫學檢驗已成為檢驗醫學進展最快的一個領域。目前，我國一些基礎及臨床實驗室，部分第三方檢測機構也已開展相關檢測項目，如腫瘤檢測（早期篩查、診斷、預后、治療、監測等）;免疫缺陷疾病等。非腫瘤檢測如產前篩查、新生兒篩查及診斷遺傳病診斷等遺傳學、藥物基因組學及感染學檢測方面廣泛應用及開展研究。與此同時，也有部分診斷試劑盒獲批上市。

隨著NGS技術和生物技術的繼續發展，基于單分子測序和合成法測序的第三代測序平臺也從研究階段逐步走向應用階段，如無需擴增，實時捕獲信號的Pacific Biosciences公司的單分子實時合成測序技術（single molecule real-time，SMRT）和Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔單分子測序技術。三代NGS技術的優點是縮短了實驗準備時間，能夠有效避免一些系統錯誤，但由于方法不夠成熟，制作材料要求高等因素，目前還未廣泛推廣使用。

NGS技術對于精準檢驗醫學其他分支貢獻也頗為可觀，如NGS在心血管疾病診斷等方面，也取得了相應的進展。同時，目前已有針對NGS技術在病原體感染疾病方便應用的專家共識發布，有諸多其他文獻在這些方面均全面報道和解讀，在此不再贅述。隨著科技的發展，相信NGS技術會成為未來檢驗醫學的主要診斷手段和金標準，以滿足精準醫學不斷進展的需求與變化。

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