微小RNA-199a靶向調(diào)控沉默信息調(diào)節(jié)因子1對(duì)腦梗死大鼠神經(jīng)元凋亡的影響

林 影, 李建紅, 盧宏全, 陳俊玲

(1. 海南西部中心醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科, 海南 儋州, 571700;2. 海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科, 海南, ?？? 570100;3. 海南西部中心醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科, 海南 儋州, 571700;4. 海南省?？谑腥嗣襻t(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科, 海南 ?？? 570100)

腦梗死是臨床常見的腦血管疾病，往往由腦供血?jiǎng)用}閉塞造成腦組織缺血性壞死引起，常見臨床表現(xiàn)有腦血栓形成、腦栓塞和神經(jīng)元損傷等，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致患者失去意識(shí)、半身不遂和發(fā)生神經(jīng)功能障礙，甚至危及生命[1-3]。目前，腦梗死的醫(yī)治方法仍以藥物治療為主，即通過(guò)神經(jīng)保護(hù)類藥物、改善腦循環(huán)藥物緩解病情[4]。研究[5]顯示，多種因子參與調(diào)控腦梗死的病理過(guò)程。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)作為多個(gè)通路中重要的調(diào)控因子，可提高細(xì)胞對(duì)抗氧化應(yīng)激的能力，保護(hù)神經(jīng)元并抑制其凋亡[6]。微小RNA(miRNA)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種非編碼小分子RNA, 可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)[7]。微小RNA-199a(miR-199a)已被證實(shí)與腦缺血及神經(jīng)元損傷有密切聯(lián)系[8], 而SIRT1可能作為miR-199a的作用靶基因共同參與調(diào)控細(xì)胞炎性損傷，但相關(guān)機(jī)理有待進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究以腦梗死大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜑閷?shí)驗(yàn)對(duì)象，探討miR-199a是否通過(guò)靶向調(diào)節(jié)SIRT1而參與對(duì)腦梗死大鼠神經(jīng)元損傷的調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

miR-199a質(zhì)粒及陰性對(duì)照, miR-199a siRNA及陰性對(duì)照,SIRT1siRNA表達(dá)載體(北京擎科生物科技有限公司)。雙熒光載體(上海吉瑪制藥有限公司)，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(貨號(hào)11668030, 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(貨號(hào)C1091，上海碧云天生物技術(shù)有限公司), SIRT1抗體(貨號(hào)ab110304, 英國(guó)Abcam公司)、活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved caspase-3)抗體(貨號(hào)ab214430, 英國(guó)Abcam公司)、羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)抗體(貨號(hào)ab150113, 英國(guó)Abcam公司)、羊抗兔IgG抗體(貨號(hào)ab150077, 英國(guó)Abcam公司)，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(7500型，美國(guó)ABI公司)，凝膠成像系統(tǒng)(HE-120, 上海生工生物有限公司)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Varioskan LUX, 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 動(dòng)物模型構(gòu)建

從河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)得清潔級(jí)成年雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(200±10) g, 許可證號(hào)SCXK(冀)2018-004。隨機(jī)挑選12只大鼠納入假手術(shù)組，麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)上，暴露頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈，不設(shè)置栓線，直接縫合皮膚。將剩余48只大鼠麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)上，分離頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈，結(jié)扎左側(cè)頸外動(dòng)脈的遠(yuǎn)心端，于總動(dòng)脈近心端及頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)心端放置動(dòng)脈夾，剪斷頸外動(dòng)脈結(jié)扎處，設(shè)置栓線，打開頸內(nèi)動(dòng)脈的動(dòng)脈夾并持續(xù)推進(jìn)栓線，直至遇到阻力。阻斷大腦動(dòng)脈血流后固定栓線，縫合皮膚, 2 h后拔出栓線，進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估，依據(jù)評(píng)分判定模型是否構(gòu)建成功(評(píng)分≥3分即建模成功)，評(píng)分越高表明神經(jīng)功能損害越嚴(yán)重。0分，無(wú)任何抽搐行為; 1分，出現(xiàn)獨(dú)立的肌痙攣; 2分，出現(xiàn)短暫的全身性痙攣; 3分，出現(xiàn)全身性強(qiáng)直痙攣; 4分，后肢出現(xiàn)站立和跌倒; 5分，反復(fù)抽搐，難以站立。將48只大鼠隨機(jī)分為腦梗死組、miR-199a抑制組、miR-199a陰性對(duì)照組、miR-199a抑制+SIRT1抑制組，每組12只。分組后第1、5天, miR-199a抑制組大鼠尾部靜脈注射miR-199a siRNA 2 mL/kg; miR-199a陰性對(duì)照組大鼠注射siRNA無(wú)意義序列2 mL/kg; miR-199a抑制+SIRT1抑制組大鼠注射miR-199a siRNA 2 mL/kg和SIRT1siRNA表達(dá)載體150 μL/kg; 腦梗死組注射等量的生理鹽水。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

末次干預(yù)3 d后進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估，隨后將各組大鼠斷頭取腦，置于磷酸鹽緩沖溶液中清洗3次，取出缺血側(cè)大腦半球組織，部分用液氮處理后凍存?zhèn)溆?，部分置?%多聚甲醛中固定備用，剩余部分用手術(shù)剪徹底剪碎，加入5 mL 0.4%胰蛋白酶置于37 ℃水浴鍋中1 h, 期間不斷搖晃使組織充分裂解，而后將胰蛋白酶吸凈，加入磷酸鹽緩沖溶液充分吹打，以400目金屬網(wǎng)過(guò)篩，加入磷酸鹽緩沖溶液稀釋為單細(xì)胞懸液，反復(fù)吹打，靜置1 h。1 000轉(zhuǎn)/min離心3 min, 離心半徑8 cm, 洗滌3次，加入細(xì)胞固定液1 mL, 4 ℃過(guò)夜處理, 1 000 轉(zhuǎn)/min離心3 min, 離心半徑8 cm, 去除固定液，加入50 μg/mL二苯基氯化碘鹽液0.5 mL, 4 ℃避光染色30 min, 應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)神經(jīng)元凋亡情況。

1.4 HE染色

取出固定備用的缺血側(cè)大腦半球組織，以不同濃度乙醇梯度脫水，二甲苯染色透明，石蠟包埋后切片處理，厚度5 μm, 蘇木精染色3 min, 清水洗凈后加入低濃度鹽酸酒精分化直至返藍(lán)，用0.5%伊紅染色3 min, 不同濃度酒精梯度脫水，二甲苯透明，樹脂封片后置于顯微鏡下觀察病理學(xué)變化。

1.5 熒光定量PCR檢測(cè)

取出事先冷存?zhèn)溆玫娜毖獋?cè)大腦半球組織，研磨成粉，采用Trizol法提取組織RNA，檢測(cè)RNA濃度，而后反轉(zhuǎn)錄，上機(jī)檢測(cè)SIRT1mRNA、miR-199a表達(dá)水平。mRNA引物序列用Primer 3.0軟件設(shè)計(jì)，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。引物序列見表1。

表1 引物序列信息

1.6 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)分析

取出事先冷存?zhèn)溆玫娜毖獋?cè)大腦半球組織，研磨成粉，加入蛋白裂解液處理，不斷振蕩使蛋白裂解充分，加入0.5 mL提取液，靜置5 min, 4 ℃下10 000轉(zhuǎn)/min離心3 min, 取上層清液干燥5 min, 與上樣緩沖液混合加熱10 min, 倒入10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠板孔道中電泳，取出轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉2 h, 腦組織蛋白中加入一抗[甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、SIRT1抗體、Cleaved caspase-3抗體, 1∶1 000], 4 ℃孵育過(guò)夜。棄封閉液，用TBST緩沖液清洗3次, 5 min/次。加入二抗(1∶1 500), 常溫孵育45 min, 用TBST緩沖液清洗3次, 5 min/次。將發(fā)光液倒于膜上，浸泡1 min, 將膜取出，用吸水紙吸去多余液體，置于Syngene光密度掃描系統(tǒng)上，進(jìn)行條帶灰度分析。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-199a與SIRT1 3′-UTR的結(jié)合作用

構(gòu)建包含miR-199a靶位點(diǎn)的SIRT13′-UTR插入熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3, 構(gòu)建野生型重組報(bào)告基因載體(pGL3-SIRT1-WT), 同時(shí)構(gòu)建包含結(jié)合序列突變的突變型重組報(bào)告基因載體(pGL3-SIRT1-MUT), 構(gòu)建方法參照文獻(xiàn)[9]。將2種基因載體與miR-199a質(zhì)粒及miR-199a陰性對(duì)照質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)染于HEK293細(xì)胞中。細(xì)胞培養(yǎng)后裂解細(xì)胞，測(cè)定熒光素酶發(fā)光強(qiáng)度，根據(jù)雙熒光素酶活性報(bào)告系統(tǒng)判斷miR-199a與SIRT13′-UTR結(jié)合作用的強(qiáng)弱。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 miR-199a對(duì)腦梗死大鼠神經(jīng)功能的影響

與假手術(shù)組相比，其余4組處理前后的神經(jīng)學(xué)評(píng)分均更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。假手術(shù)組、腦梗死組、miR-199a陰性對(duì)照組處理后的神經(jīng)學(xué)評(píng)分與處理前比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。處理后, miR-199a抑制組、miR-199a抑制+SIRT1抑制組神經(jīng)學(xué)評(píng)分均低于腦梗死組和處理前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); miR-199a陰性對(duì)照組、miR-199a抑制+SIRT1抑制組處理后神經(jīng)學(xué)評(píng)分均高于miR-199a抑制組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

分

2.2 miR-199a對(duì)腦梗死大鼠腦組織SIRT1mRNA、miR-199a表達(dá)的影響

腦梗死組大鼠腦組織miR-199a表達(dá)量高于假手術(shù)組,SIRT1mRNA表達(dá)量低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與腦梗死組、miR-199a陰性對(duì)照組相比, miR-199a抑制組、miR-199a抑制+SIRT1抑制組miR-199a表達(dá)量降低,SIRT1mRNA表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); miR-199a陰性對(duì)照組SIRT1mRNA、miR-199a表達(dá)量與腦梗死組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 與miR-199a抑制組相比, miR-199a抑制+SIRT1抑制組miR-199a表達(dá)量升高,SIRT1mRNA表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠腦組織SIRT1 mRNA、miR-199a表達(dá)量比較

2.3 miR-199a對(duì)腦梗死大鼠腦組織SIRT1蛋白表達(dá)的影響

腦梗死組大鼠腦組織SIRT1蛋白表達(dá)量低于假手術(shù)組, miR-199a抑制組、miR-199a抑制+SIRT1抑制組SIRT1蛋白表達(dá)量均高于miR-199a陰性對(duì)照組、腦梗死組, miR-199a抑制+SIRT1抑制組SIRT1蛋白表達(dá)量低于miR-199a抑制組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); miR-199a陰性對(duì)照組SIRT1蛋白表達(dá)量與腦梗死組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、表4。

A: 假手術(shù)組; B: 腦梗死組; C: miR-199a抑制組; D: miR-199a陰性對(duì)照組; E: miR-199a抑制+SIRT1抑制組。圖1 不同處理后大鼠腦組織SIRT1蛋白表達(dá)量比較

表4 各組大鼠腦組織SIRT1蛋白表達(dá)量比較

2.4 miR-199a與SIRT1 3′-UTR結(jié)合作用分析

雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與共轉(zhuǎn)染miR-199a質(zhì)粒和pGL3-SIRT1-MUT相比，共轉(zhuǎn)染miR-199a質(zhì)粒和pGL3-SIRT1-WT的熒光素酶活性更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 共轉(zhuǎn)染miR-199a質(zhì)粒和pGL3-SIRT1-MUT、共轉(zhuǎn)染miR-199a陰性對(duì)照質(zhì)粒和pGL3-SIRT1-WT、共轉(zhuǎn)染miR-199a陰性對(duì)照質(zhì)粒和pGL3-SIRT1-MUT的熒光素酶活性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

2.5 miR-199a對(duì)腦梗死大鼠神經(jīng)元凋亡及神經(jīng)功能的影響

腦梗死組神經(jīng)元凋亡率和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量高于假手術(shù)組, miR-199a抑制組、miR-199a抑制+SIRT1抑制組神經(jīng)元凋亡率和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量均低于腦梗死組、miR-199a陰性對(duì)照組, miR-199a抑制+SIRT1抑制組神經(jīng)元凋亡率和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量高于miR-199a抑制組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 腦梗死組神經(jīng)元凋亡率、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量與miR-199a陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2、圖3、表6。

A: 假手術(shù)組; B: 腦梗死組; C: miR-199a抑制組; D: miR-199a陰性對(duì)照組; E: miR-199a抑制+SIRT1抑制組。圖2 各組大鼠腦組織Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量比較

A: 假手術(shù)組; B: 腦梗死組; C: miR-199a抑制組; D: miR-199a陰性對(duì)照組; E: miR-199a抑制+SIRT1抑制組。圖3 各組大鼠神經(jīng)元凋亡情況

表6 各組神經(jīng)元凋亡率和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量比較

2.6 miR-199a對(duì)腦梗死大鼠缺血側(cè)腦皮層組織病理變化的影響

假手術(shù)組大鼠腦組織及皮層神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，無(wú)明顯變性及膠質(zhì)細(xì)胞增生; 腦梗死組大鼠腦組織出現(xiàn)變性，神經(jīng)元壞死，腦組織稀松且出現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞增生; 與腦梗死組相比,miR-199a抑制組、miR-199a抑制+SIRT1抑制組腦組織變性得到緩解，膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少，神經(jīng)元壞死程度緩解，腦梗死組與miR-199a陰性對(duì)照組病理形態(tài)變化相似; 與miR-199a抑制組相比, miR-199a抑制+SIRT1抑制組腦組織變性程度加劇，神經(jīng)元壞死數(shù)量增多。見圖4。

A: 假手術(shù)組(腦組織內(nèi)有大量神經(jīng)元); B: 腦梗死組(腦組織神經(jīng)元數(shù)量減少,出現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞); C: miR-199a抑制組(腦組織神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量增多); D: miR-199a陰性對(duì)照組(與腦梗死組相似); E: miR-199a抑制+SIRT1抑制組(腦組織神經(jīng)元恢復(fù)緩慢)。圖4 各組大鼠缺血側(cè)腦皮層神經(jīng)元組織光學(xué)顯微鏡下病理變化(HE染色,放大200倍)

3 討 論

腦梗死是常見的腦血管疾病，主要特征為神經(jīng)元損傷引起的神經(jīng)功能障礙，臨床可通過(guò)神經(jīng)保護(hù)類藥物改善病情[10-11]。miRNA是一類含有21～23個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA, 具有調(diào)控細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的生物學(xué)功能[12]。研究[13-14]發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌注損傷模型中，多種miRNA表達(dá)量變化顯著，其中高表達(dá)miR-199a被證實(shí)參與缺血耐受，可降低缺血耐受因子的表達(dá)水平，破壞神經(jīng)功能。由此推測(cè), miR-199a可能在其他腦血管類疾病如腦梗死中起調(diào)控作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，建立腦梗死大鼠模型后，大鼠神經(jīng)元凋亡率、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量和神經(jīng)學(xué)評(píng)分均顯著升高，表明腦梗死大鼠神經(jīng)元凋亡嚴(yán)重，已出現(xiàn)行為障礙。與miR-199a陰性對(duì)照組相比, miR-199a抑制組大鼠神經(jīng)元凋亡率、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量和神經(jīng)學(xué)評(píng)分均顯著降低，說(shuō)明抑制miR-199a表達(dá)會(huì)抑制凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase-3表達(dá)，減緩神經(jīng)元凋亡，改善大鼠行動(dòng)能力，與相關(guān)研究[15]結(jié)論一致。腦組織是腦血管疾病的主要危害部位，而其在動(dòng)物神經(jīng)功能中發(fā)揮著重要作用[16-17]。本研究對(duì)大鼠腦組織切片進(jìn)行HE染色觀察，發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組具有完整的腦組織結(jié)構(gòu)，腦梗死組腦組織出現(xiàn)明顯變性和神經(jīng)元壞死，與miR-199a陰性對(duì)照組相比, miR-199a抑制組神經(jīng)元壞死程度得到緩解，腦組織結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)，充分證明抑制miR-199a對(duì)腦組織具有保護(hù)作用，但其作用機(jī)理仍待進(jìn)一步探索。

有研究[18-19]指出,SIRT1對(duì)腦組織具有保護(hù)性作用,SIRT1高表達(dá)可抑制凋亡相關(guān)因子，減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡，猜測(cè)SIRT1可能作為miR-199a的作用靶基因共同參與調(diào)控神經(jīng)元損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，腦梗死組大鼠腦組織中miR-199a表達(dá)量顯著升高,SIRT1mRNA和SIRT1蛋白表達(dá)量顯著降低，表明腦梗死會(huì)降低SIRT1表達(dá)，促進(jìn)凋亡因子生長(zhǎng)，破壞神經(jīng)元，與相關(guān)研究[20]結(jié)論一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，與miR-199a陰性對(duì)照組相比, miR-199a抑制組大鼠腦組織SIRT1mRNA和SIRT1蛋白表達(dá)量均顯著升高，表明抑制miR-199a表達(dá)可進(jìn)一步調(diào)控SIRT1表達(dá)，緩解神經(jīng)元的凋亡。為了進(jìn)一步探究miR-199a與SIRT1的靶向關(guān)系，本研究添加干擾SIRT1的siRNA和干擾miR-199a的siRNA抑制的腦梗死大鼠進(jìn)一步比較，發(fā)現(xiàn)miR-199a抑制+SIRT1抑制組神經(jīng)元凋亡率、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量、處理后神經(jīng)元評(píng)分顯著高于miR-199a抑制組，且SIRT1mRNA和SIRT1蛋白表達(dá)量顯著降低，大鼠腦組織變性加劇。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示, miR-199a可與野生型SIRT13′-UTR特異性結(jié)合，進(jìn)一步證實(shí)兩者具有靶向關(guān)系，并推測(cè)抑制miR-199a表達(dá)對(duì)腦梗死大鼠神經(jīng)元凋亡的調(diào)控作用可能與其靶向調(diào)控SIRT1表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，抑制miR-199a表達(dá)可靶向調(diào)控SIRT1, 在轉(zhuǎn)錄水平上促進(jìn)SIRT1表達(dá)，提高SIRT1mRNA和SIRT1蛋白含量，進(jìn)而抑制Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)，緩解神經(jīng)元凋亡，改善神經(jīng)元壞死情況，恢復(fù)腦梗死大鼠的腦組織結(jié)構(gòu)，減輕腦梗死病情。miR-199a可作為腦梗死治療藥物作用的新靶點(diǎn)，但miR-199a是否還通過(guò)其他通路間接參與調(diào)控神經(jīng)元凋亡有待進(jìn)一步證實(shí)。