APP在TGF β誘導的前列腺癌PC-3細胞轉移過程中的作用機制

孫國慶 鄭保良 胡耀宇

最近的統計數據表明中國前列腺癌發病率逐年上升，有可能成為威脅男性健康的最主要殺手[1-3]。目前雖然有多種前列腺癌治療方案，包括手術切除、去勢、放化療以及其他姑息療法，但是其5年生存率尚不能達到理想水平[3-6]。前列腺癌的轉移常發生于骨、肺等器官[7-9]，已有大量研究表明其轉移與多種信號和分子相關[7]，但是關于其轉移發生的決定性機制并沒有定論。近年的研究表明淀粉樣前體蛋白(APP)在腫瘤的血行轉移中具有重要作用[10-11]，當在腫瘤細胞中過表達APP后，腫瘤細胞轉移能力顯著上升[12-14]。與此同時，在宮頸癌，前列腺癌以及結腸癌和胰腺癌患者的癌癥組織中也檢測到APP的顯著高表達，且患者預后與APP的表達呈負相關[15-17]。但是在腫瘤組織中，APP為什么呈高表達并無研究報道，了解其上調表達可能有助于尋找腫瘤治療的新靶點。已有大量研究表明TGF β在多種腫瘤的發生、發展、轉移和免疫逃逸中具有重要意義[18-20]。一方面，TGF β可以通過促進T細胞分化為Treg細胞，從而抑制腫瘤免疫的發生[21-23]；另一方面，TGF β也可以通過促進腫瘤細胞中多種基因的表達從而促進腫瘤細胞的遷移[24-26]，但是目前尚無研究表明TGF β與前列腺癌細胞APP的表達之間具有相關性，因此本研究旨在證實APP與TGF β誘導的前列腺癌細胞遷移和侵襲的相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

前列腺癌PC-3細胞株購自中國醫學科學院腫瘤醫院；RPMI 1640培養基購自Hyclone公司；胎牛血清購自Gibco公司；total RNA提取試劑盒購自碧云天試劑公司；逆轉錄試劑盒和SYBR購自TAKARA公司；β actin、APP、p-Smad 1、p-Smad 2、smad兔抗人一抗和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗購自CST；TGF β購自Protein tech公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自碧云天；引物由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和實驗分組 前列腺癌PC-3細胞培養于含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM-F12完全培養基中，置于37℃，含有5%的CO2細胞孵育箱，培養2～3天待密度達到90%時1∶3傳代。

1.2.2 細胞遷移和侵襲檢測 參照TGF β在其他癌細胞的研究中方法設計實驗，細胞以1×105個/孔的密度接種至24孔板之后，適應生長24 h更換培養基，待細胞生長至對數生長期，加入20 ng/ml的TGF β處理48 h[27-28]，收集并用基礎培養基重懸細胞，添加至Transwell遷移小室上腔，下腔加入FBS終濃度為6%的含血清培養基。上下腔組合完整，繼續培養3 h。終止遷移后取出上腔，用棉簽除去聚碳酸酯膜內壁未遷移細胞，晾干后用終濃度為0.1%的結晶紫染液于37 ℃染色15 min，取出再次晾干后于倒置顯微鏡下觀察計數并拍照。

侵襲實驗：Transwell遷移小室上腔預先添加基質膠溶液，待基質膠沉積于碳酸酯膜之后吸棄廢液，如上所述重懸細胞后加入上腔，繼續培養24 h并如上染色并拍照。

1.2.3 實時熒光定量PCR實驗 處于對數生長期細胞消化重懸后，以每孔5×105個的密度接種到6孔板中，保證密度在40%左右，培養過夜后，依照試劑盒說明書提取細胞總RNA，檢測濃度后按照試劑盒說明書經逆轉錄構建cDNA，程序為 37 ℃孵育15 min，85 ℃反應5 sec，反應結束保存于4 ℃。隨后按照試劑盒說明書進行qPCR反應，程序為95 ℃預變性15 sec；95 ℃變性5 sec，62 ℃退火30 sec，進行40個循環。結果以β actin為內參，通過2-△△ct計算相對表達量。引物序列如下所述：β actin上游：CTCCATCCTGGCCTCGCTGT；下游：GCTGTCACCTTCACCGTTCC。APP上游：CAAGCAGTGCAAGACCCATC；下游：AGAAGG-GCATCACTTACAAACTC。

1.2.4 蛋白印跡實驗 處于對數生長期細胞消化重懸后，以每孔5×105個的密度接種到6孔板中，保證密度在40%左右，適應培養過夜后，提取細胞總蛋白，使用BCA法檢測總蛋白濃度，加入相應體積的上樣緩沖液并煮沸5 min后凍存于-20℃。配制SDS-PAGE凝膠后對上述樣本進行電泳分離，轉移至PVDF膜上，5% BSA室溫封閉2 h，添加β actin、APP、p-Smad 1、p-Smad 2、smad稀釋的一抗，4℃孵育過夜，TBST清洗，添加已經稀釋的HRP-IgG二抗，室溫孵育2 h，TBST清洗后使用發光液進行曝光，以β actin作為內參，統計相應蛋白的相對表達量。

1.3 統計方法

所有的統計數據以均數±標準差表示，兩組間比較在SPSS 21.0軟件中使用雙尾t檢驗進行差異性統計，多組間兩兩比較使用單因素方差分析進行統計，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TGF β對前列腺癌細胞遷移和侵襲的作用

前列腺癌細胞常規培養后，使用相應濃度的TGF β處理細胞，通過遷移小室檢測TGF β對前列腺癌PC-3細胞遷移、侵襲能力的影響。結果如圖1、圖2所示，20 ng/ml的TGFβ能顯著提升腫瘤細胞的遷移能力，即增加了細胞跨膜遷移侵襲的數目(P<0.05)。

注：*表示P<0.05，差異具有統計學意義。

注：*表示P<0.05，差異具有統計學意義。

2.2 TGF β通過Smad途徑對APP表達的促進作用

前列腺癌細胞常規培養后，使用相應濃度的TGF β處理細胞，提取總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳檢測TGF β對Smad信號通路相關分子活化水平的影響。結果如圖3所示，20 ng/ml的TGF β顯著提升腫瘤細胞Smad 1和Smad 2的磷酸化水平(P<0.05)。 前列腺癌細胞常規培養后，使用相應濃度的TGF β處理細胞，提取總蛋白和總RNA后進行SDS-PAGE凝膠電泳和qPCR檢測，結果如圖4所示，無論在轉錄水平還是翻譯水平，20 ng/ml的TGF β都顯著提升腫瘤細胞APP的表達(P<0.05)。

注：A為凝膠電泳圖；B為蛋白印跡灰度值的統計結果。*表示P<0.05，差異具有統計學意義。

注：A為凝膠電泳圖；B為蛋白印跡灰度值的統計結果；C為qPCR檢測細胞的相對基因含量的統計結果。*表示P<0.05，差異具有統計學意義。

2.3 LY2109761對TGFβ/Smad途徑誘導的APP表達的抑制作用

前列腺癌細胞常規培養后，使用相應濃度的TGF β處理細胞，提取總蛋白和總RNA后進行SDS-PAGE凝膠電泳和qPCR檢測TGF β對Smad信號通路相關分子活化水平以及APP表達水平的影響。結果如圖5所示，Smad抑制劑LY2109761能夠逆轉TGF β的生物學效應，即降低Smad 1和Smad 2的磷酸化水平(P<0.05)，并下調APP的表達(P<0.05)。

注：A為SPS-PAGE凝膠電泳圖；B為蛋白印跡灰度值的統計結果；C為qPCR檢測各組細胞的相對基因含量的統計結果。*表示與對照組相比，P<0.05，差異具有統計學意義；#表示與TGF β處理組相比，P<0.05，差異具有統計學意義。

2.4 APP表達對PC-3細胞的遷移和侵襲的影響

采用TGF β/Smad前列腺癌細胞常規培養后，使用相應濃度的TGF β處理細胞，同時使用Smad抑制劑LY2109761處理細胞控制細胞內APP的表達，通過遷移小室檢測TGF β或TGF β+Smad抑制劑對前列腺癌PC-3細胞遷移和侵襲能力的影響。結果如圖6所示，APP表達高的組別其遷移和侵襲能力明顯高于對照組(P<0.05)，而在對APP表達加以抑制后，細胞的遷移侵襲能力明顯下降(P<0.05)。

注：A為各組細胞的遷移能力；B為遷移各組細胞的侵襲能力；C為遷移實驗的統計結果。D為侵襲實驗的統計結果。*表示與對照組相比，P<0.05，差異具有統計學意義；#表示與TGF β處理組相比，P<0.05，差異具有統計學意義。

3 討論

前列腺癌的轉移一直是其治療的難點，也是腫瘤患者生存率不佳的主要原因[1,27-28]。前列腺癌的轉移與多種因素相關[1,4]，但是目前尚無定論，因此深入研究其轉移的機制有助于找到新的治療靶點。

APP是近年發現的一個促進腫瘤轉移的細胞膜蛋白，在多種腫瘤組織中顯著高表達[14-16]。TGF β與多種腫瘤的轉移相關[21,24]，然而TGFβ在前列腺癌中的機制尚未清楚。本研究通過遷移小室實驗初步證實TGF β能夠促進前列腺癌PC-3細胞的遷移和侵襲。在進一步研究中，發現TGF β能夠在轉錄和翻譯水平顯著上調APP的表達水平，且對此效應產生的APP表達的抑制能夠明顯降低細胞的遷移和侵襲水平。這提示TGF β可能通過上調APP的表達水平產生上述效應。

研究表明，Smad 1和Smad 2磷酸化后處于激活狀態，能夠移位入核影響下游靶基因的轉錄[29-31]，并以此調控細胞的生物學功能。在對TGF β對前列腺癌影響的機制研究中，本研究檢測了TGF β下游分子Smad 1和Smad 2的磷酸化水平，結果發現TGF β顯著上調了Smad 1和Smad 2的磷酸化，從而促進其入核并調節其下游的基因APP的表達。當使用Smad 抑制劑LY2109761處理后，發現此途徑引起的APP表達也受到抑制，遷移小室證實細胞的遷移和侵襲能力也隨之減弱，這說明APP的表達與前列腺癌細胞的侵襲和遷移能力密切相關。

盡管如此，本實驗仍然存在缺陷。本實驗采用的APP表達抑制方法存在缺陷，只能夠通過抑制TGF β/Smad通路途徑實現，這會使得此通路下游的各種蛋白情況均受到影響，對實驗造成干擾。關于APP在前列腺癌中的作用仍然存在爭議。BCR survival圖顯示APP在前列腺癌中起抑癌作用，與本文結果相反。這可能是由于本次實驗采取的APP抑制方法導致了其他一些蛋白的抑制，從而對實驗結果產生了干擾。本文僅探討了APP對前列腺癌細胞增殖遷移的影響，不能完全反映APP在癌細胞中的其他作用。此外，本次實驗結果是在體外條件得到的，在體內前列腺癌細胞的增殖和遷移還受到各種因素的調節，因此APP對機體內癌細胞的作用還需要進一步探討。

總體而言，本研究初步證實TGF β/Smad通路能夠使得前列腺癌細胞中的APP水平上調，并可能通過此途徑促進前列腺癌細胞的遷移和侵襲，APP很可能是前列腺轉移抑制的新靶點。