污染土壤修復技術專利分析

文|白鴿

土壤是人類生產活動的重要物質基礎，是不可缺少、難以再生的自然資源，其管理使用的好壞直接決定著農業生產的成敗和人類文明的興衰。隨著社會經濟、科技、工業、建筑的飛速發展和高強度的人類活動，以及對后備土地的過度開發利用，可供使用的土壤資源日益緊張，土壤的流失和污染極為嚴重，已經影響到可持續發展的戰略目標。因此，對污染土壤進行分析和修復勢在必行。本文調查研究了我國利用微生物修復污染土壤的專利申請概況，結合具體專利文獻對微生物修復專利技術進行了介紹。微生物修復土壤污染是一種高效、經濟、綠色環保的生態修復技術。一方面，在降解、轉化及固定污染物的微生物篩選、廣譜性、高效性的研究工作還有待進一步開展。另一方面，應加強已有技術成果的轉化，有序促進土壤修復產業發展，使基礎的理論研究用于指導實踐，發揮更大的社會和經濟效益。

根據修復原理的不同，污染土壤修復可分為物理修復、化學修復和生物修復三種類型。由于生物修復技術較物理、化學方法經濟，不易產生二次污染，且具有低耗、高效、環境安全等優點，因而近幾年發展迅猛，已經成為污染土壤修復技術最活躍的領域。根據污染土壤生物修復主體不同，生物修復技術進一步分為微生物修復、植物修復和動物修復，其中以微生物修復應用最為廣泛。

1 土壤污染修復相關專利技術發展態勢

以專利數據庫作為數據采集來源，以關鍵詞（土壤、污染、微生物、修復）和分類號作為主要檢索要素，對2021年12月31日之前公開的專利文獻進行檢索，獲得中國發明專利及中國發明專利申請3407條，上述結果作為統計分析的基礎數據。

1.1 相關專利技術現狀分析

1.1.1 專利技術申請趨勢分析

從圖1可以看出，相關專利申請的申請量總體呈增長趨勢，特別是2014年后增長更為突出，說明土壤污染問題越來越被關注和重視，越來越多的創新主體積極參與研發，2018年專利申請量達到頂峰。由于發明專利文獻最遲可在發明專利申請提出后18個月公開，因此2020年和2021年提出的專利申請還有部分尚未公開。

圖1 土壤污染修復技術申請趨勢圖

1.1.2 專利申請人類型分布情況

通過對3407條專利文獻進行分析，專利申請人中大專院校占比最大，其次為企業、科研單位，余下少量為個人、機關團體或其它。圖2表明，目前為止，大專院校和科研單位是技術研發和改進的主力軍，專利技術需要積極轉化產生價值，需要進一步加強產學研結合，從科研院校的實驗室研究轉化為產業化運用，提高土壤污染修復的有效性。

圖2 土壤污染修復技術申請人類型分布圖

2 土壤污染的類型和危害

根據污染物類型，土壤污染大致可分為無機污染物和有機污染物兩大類。無機污染物主要包括酸、堿、重金屬、鹽類、放射性元素等。有機污染物主要包括農藥、酚類、氯化物、石油、合成洗滌劑等。土壤污染一方面會造成土壤肥力降低、土壤退化，甚至導致地下水污染，威脅生態環境安全；另一方面土壤中的污染物質通過食物進入人體，對人體健康構成極大危害。可見，土壤污染直接關系到食品安全和人類健康。

對前述3407條檢索結果進一步細分，其中涉及土壤重金屬污染及修復的1126條、涉及有機農藥污染及修復的1127條，同時涉及重金屬污染和有機農藥污染的321條。

2.1 土壤污染的類型及重點申請人

圖3顯示，有機農藥和重金屬離子是土壤污染修復的重點。在有機農藥污染修復技術中，中南大學和湖南省農業生物技術研究中心專利申請量較多；在重金屬污染修復技術中，以華中農業大學以及北京林業大學、華南農業大學、南京農業大學4所農林院校為主。

圖3 土壤污染修復技術重點類型分布圖

2.2 重金屬污染及其危害

土壤重金屬污染是指由于人類活動將金屬加入到土壤中，致使土壤中重金屬明顯高于原生含量、并造成生態環境質量惡化的現象。重金屬通常是指比重等于或大于5.0的金屬，包括鉛、鉻、汞、鋅、銅、鎳等，砷的化學性質和環境行為與重金屬多有相似之處，因而在討論重金屬時往往也包括砷。這些重金屬元素進入水體和土壤以后通過植物吸收積累在植物的根、莖、葉、果等可食用部分，或通過葉面直接進入植物體，從而對植物和動物產生毒害作用。高濃度的鉛除了在作物可食部分產生殘毒外，還會導致幼苗萎縮、生長緩慢、產量下降。高濃度的鎘會使谷物類作物出現類似于缺鐵的萎黃病、枯斑病、萎蔫，葉片產生紅棕色斑塊和莖生長受阻。砷在自然界以不同形態存在，三價砷毒性大于五價砷，大于有機砷。鉻是人體必需的微量營養元素，但鉻的缺乏或過量將對人體和動物產生嚴重危害，一般認為二價鉻是無毒的，三價鉻是動物體必需的活性元素，六價鉻是主要的環境污染物之一，鉻的毒害主要表現在植物根部、地上部出現缺鐵失綠現象。此外，我國是汞儲備大國，也是土壤汞污染最為嚴重的國家。近幾年我國人為排汞量在全球排放中的比重持續增大，每年達到600t左右。甲基汞的毒性比無機汞大得多，它是一種親脂性高毒物，能引起中樞神經系統疾病，為不可逆的中毒反應。

2.3 有機農藥污染及其危害

在我國北方地區，主要農作物有大豆、玉米與小麥，同時還可以種植蔬菜、中草藥以及其他雜糧作物。北方地區主要以黑土地為主，土壤較為肥沃，只需要施加少量的肥料，即可促進作物生長。然而，農民為了提高產量、獲得更多的經濟效益，會過度使用農藥，從而對土壤造成嚴重破壞，對人類生活造成一定威脅。

為了防治植物病蟲草害，在二十世紀末有機氯農藥被大量生產和過量使用，主要分為以苯為原料和以環戊二烯為原料的兩大類，前者包括廣泛使用的殺蟲劑DDT和六六六，以及殺螨劑三氯殺螨砜、三氯殺螨醇等，殺菌劑五氯硝基苯、百菌清等。同樣對植物病有防治效果的還包括有機磷農藥，我國水稻田中主要施用有機磷殺蟲劑，包括有敵敵畏、敵百蟲、樂果、毒死蜱和草甘膦等。

一般認為，農藥在施用環境條件中的有效利用率僅僅達到10%-20%，其余80%-90%的農藥流失于農田土壤、河流、地下水及揮發至空氣中。農藥首先噴灑至土壤中，然后經揮發和淋溶進入空氣和水體中，因此土壤中的農藥殘留濃度最大，農藥污染程度最高。土壤中殘留的農藥會通過植物的根系活動逐漸轉移至植物中，使得植物中的農藥殘留量增大，影響農產品的質量。農藥進入土壤后，除了殺傷防治對象，還殺害土壤中其它的生物群。有機氯、有機磷農藥還可經消化道、呼吸道及完整的皮膚和黏膜進入人體。有機氯農藥可引起不同程度的中毒，急性中毒表現為刺激神經中樞，慢性中毒表現為食欲不振、體重減輕，也可產生小腦失調、造血系統障礙等。有機磷農藥進入人體后分布于各器官，以肝臟含量最大，腦內含量取決于農藥穿透血腦屏障的能力，嚴重時可因肺水腫、腦水腫、呼吸麻痹而死亡。

3 土壤污染微生物修復技術重點專利分析

微生物修復是指利用天然存在的或者篩選培養的功能微生物或微生物群，包括土著微生物、外源微生物、誘變微生物和基因工程菌，在人為優化的適宜環境條件下，促進或強化微生物代謝功能，從而達到降低有毒污染物活性或降低有機污染物的有效性，從而間接起到修復污染土壤的作用。通常，一種微生物能夠降解多種有毒污染物，因此微生物修復成為污染土壤修復的重要領域。

3.1 從自然界篩選土壤污染修復微生物

從自然界獲得天然存在的土壤污染修復微生物的主要方法是從污染環境中取樣，通過馴化、篩選、分離等操作得到對污染物具有耐受性或者能夠降解、吸附污染物的微生物菌株。由于特定微生物菌株的篩選方法可能涉及不能重復再現、具有隨機性等實用性缺陷，因而保護主題通常為產品權利要求。例如：CN111235076B專利文獻公開了一種天神芽孢桿菌及其應用。從電鍍廠周邊土壤及水取樣，在含有Ca3(PO4)2 的解磷菌篩選培養基中進行初篩，獲得17株解磷菌。進一步復篩，得到四株解磷效果達到50%以上且對金屬鎘具有修復效果的菌株，其中菌株P46效果最佳，經鑒定為天神芽孢桿菌。進一步通過重金屬修復實驗證實，菌株P46對二價鎘離子、二價鉛離子具有較強的鈍化效果，修復效率分別可達到60%和83%以上。

CN105602855B專利文獻公開了一株具有廣譜農藥降解特性的真菌PA F-2（分類命名為聚多曲霉）及其應用。采集湖北省蘄州鎮蘄農化工有限公司新廠區周邊土樣及排水口水樣，富集培養、分離篩選得到一株具有廣譜抗性的真菌PA F-2，能夠降解包括有機磷（例如敵百蟲）、有機氯（例如百草枯）在內的13種農藥。在加入真菌PA F-2后，敵百蟲分子發生水解反應，導致分子內的C-P鍵斷裂，從而產生亞磷酸二甲酯和水合氯醛分子，亞磷酸二甲基分子在微生物體內進一步降解為微生物可利用的磷酸鹽；水合氯醛分子轉化為三氯乙醛，水合氯醛以及三氯乙醛在微生物體內可被利用為碳源，合成葡糖苷酸，從而促進微生物的生長。同時，真菌PAF-2還可進一步降解敵百蟲的水解產物敵敵畏，形成三甲基正磷酸鹽和二氯甲烷，或者發生水解反應形成甲基磷酸二甲酯和不穩定化合物二氯乙烯醛，最終也轉化為磷酸化合物。

3.2 基因工程化改造土壤污染微生物

盡管從自然界分離篩選的微生物能夠在一定程度上實現污染物的降解，實現土壤的修復，但是其降解類型、降解效率受微生物對污染物降解能力和諸多環境條件的限制，因而進一步提高微生物對污染物的降解能力是本領域的普遍需求。由此，通過基因重組、構建高效基因工程菌的研究逐漸展開。構建基因工程菌可以考慮重組改造微生物的遺傳背景，引入降解污染物的代謝通路，引入外源基因通過重組互補代謝途徑、改變污染物代謝產物流向來優化污染物的降解途徑。例如：金屬硫蛋白是具有結合金屬能力和高誘導特性的低分子量蛋白質，富含半胱氨酸的短肽，對多種金屬具有高度親和性。基于該特性，CN101892187B、CN103205454B專利文獻公開了重組表達金屬硫蛋白的基因工程菌及其在重金屬修復中的應用。以CN103205454B為例，通過將來源于釀酒酵母的磷酸甘油酸激酶基因啟動子、金屬硫蛋白基因構建重組表達載體，線性轉化釀酒酵母S.cerevisiae4126細胞內，篩選具有重金屬吸附功能的金屬硫蛋白轉基因酵母。實驗證實，經過表達金屬硫蛋白的基因工程菌能夠增強宿主對銅、鉻、鎘離子的耐受性，使菌體對重金屬的耐受性明顯提高。并且，金屬硫蛋白轉基因重組菌對六價鉻的還原速率（14h）遠遠大于出發菌（21h），在總鉻的去除率上金屬硫蛋白轉基因重組菌也要優于出發菌株。銅離子吸附實驗中，金屬硫蛋白轉基因重組菌對銅離子的吸附量是出發菌株的3倍多，顯著提高了S.cerevisiae4126對銅離子的吸附能力。可見，通過導入具有重金屬吸附功能的金屬硫蛋白多拷貝整合載體能顯著增強S.cerevisiae4126對重金屬的吸附能力。

3.3 土壤污染修復微生物誘變菌株

人工誘變例如紫外照射、離子束流轟擊等會導致微生物內部產生DNA斷裂、基因突變、基因重組等現象，以誘發微生物體內染色體變異，改變其特性，從而篩選出具有優良變異品質的土壤污染修復微生物誘變菌株。例如：CN102690763B專利文獻公開了一種具有解磷能力的成團腸桿菌，其是以具有較高解磷能力的成團腸桿菌作為出發菌株，通過紫外線誘變進行初篩，選出一株解磷活性高且穩定性好的菌株，制成菌懸液，進一步通過等離子體誘變復篩，得到一株耐受重金屬且解磷活性最高的菌株。經鑒定，菌株與成團腸桿菌具有高度同源性。

3.4 土壤污染微生物復合菌劑

單一微生物降解菌的降解譜不夠廣、不能完全代謝土壤中的污染物類型是微生物修復效果欠佳的一個主要原因。使用特定功能的復合微生物菌，微生物之間協同作用，從而改善土壤中難降解的污染物，具有高效率、低成本的特點，在微生物修復污染土壤的應用中具有廣闊的前景。所述微生物可以從保藏菌種庫中篩選獲得，也可以從自然界篩選分離得到。